4－羥基環孢菌素A衍生物[γHyMeLeu4］CyA生產菌的接合轉移

劉 靜，戴 夢，章 麗，趙 穎，鄭桂珍，張 佳，王富強

（華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司 微生物藥物國家工程研究中心河北省工業微生物代謝工程技術研究中心，河北 石家莊050015）

環孢菌素 A[1］（Cyclosporin A，CyA）作為高效免疫抑制劑廣泛應用于器官移植，不同生物活性的CyA衍生物，具有抗真菌、抗炎、抗寄生蟲、抗 HIV等功能[2］。

作者前期分離得到一株稀有放線菌CYA4OH，經16SrDNA鑒定，屬于野野村菌（Nonomuraeasp.），該菌可以在CyA底物的4－位引入羥基，得到4－羥基CyA 衍生物[γHyMeLeu4］CyA。[γHyMeLeu4］CyA自身缺乏免疫抑制活性[3］，但具有潛在的抗真菌活性，還可以作為中間體進一步合成多種具有活性的藥物。

pZMW質粒[4］含有PermE啟動子和病毒φC31的整合位點（attP），可以通過接合轉移將外源基因轉入到糖多孢紅霉菌染色體中。野野村菌與糖多孢紅霉菌同屬放線菌類，作者在此構建了以硫鏈絲菌素抗性基因tsr為報告基因的表達載體pZMW－tsr，將其轉入大腸桿菌（Escherichia coli）ET12567（pUZ8002），采用接合轉移法將tsr基因轉入 [γHyMeLeu4］CyA 生 產 菌CYA4OH，嘗試在CYA4OH菌中表達外源基因，為其轉化機制及基因工程改造研究提供參考。

1 實驗

1.1 菌種、質粒與培養基

本研究所用菌種均為自行保存。CYA4OH為[γHyMeLeu4］CyA生產菌，大腸桿菌DH5α為常規克隆和分子操作的宿主菌，大腸桿菌ET12567（pUZ8002）為接合轉移供體菌。

克隆載體pGEM－T購自Promega公司；表達載體pZM[5］、pZMW[4］為張部昌博士惠贈。

MS培養基：甘露醇2%，黃豆餅粉2%，瓊脂1.5%。

ISP2斜面培養基：酵母提取物0.4%，麥芽提取物1%，葡萄糖0.4%，瓊脂1.5%，pH 值7.3。

種子培養基：淀粉1.0%，葡萄糖0.7%，麥芽粉0.5%，酵母提取物0.45%，蛋白胨0.5%，碳酸鈣0.005%，pH 值7.0。

2×YT培養基：胰蛋白胨1.6%，酵母抽提物1%，NaCl 0.5%，pH 值7.0。

1.2 主要試劑與儀器

PCR試劑、DNA Marker、膠回收試劑盒、連接試劑盒DNA Ligation Kit Ver 2.0，Takara公司；瓊脂糖、限制性內切酶，Promega公司；各種抗生素，Sigma公司；Easy－DNA試劑盒，Invitrogen公司；其它試劑均為國產分析純。引物由生工生物工程股份有限公司（Sangon）合成。

C24KC型搖床，New Brunswich Scientific公司；Allegra 64R 型離心機，Beckman公司；ABI9600型PCR儀，PE公司；電泳儀，北京六一儀器廠；LAS3000型成像儀，FUJIFILM公司。

1.3 pZMW－tsr表達載體的構建

硫鏈絲菌素抗性基因tsr的擴增引物tsr1：5′－ccCATATGactgagttggacacc－3′，tsr2：5′－ccTTAATTAAatcggttggccgc－3′。分別在基因上游引入NdeⅠ位點，下游引入PacⅠ位點。

從載體pZM中擴增得到tsr基因片段，25μL反應體系中含10×LA－Taq酶緩沖溶液2.5μL、2.5 mmol·L－1dNTP 2μL、10μmol·L－1引 物 各0.5μL、LA－Taq酶0.2μL、模板質粒30ng。擴增條件為：95℃預變性5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，循環30次；最后72℃延伸10min。tsr片段經純化后克隆至pGEM－T載體中。使用內切酶NdeⅠ與PacⅠ將tsr片段切下，同時用這兩種酶處理載體pZMW；連接構建pZMW－tsr表達載體。將pZMW－tsr轉入大腸桿菌ET12567（pUZ8002）。

1.4 [γHyMeLeu4］CyA生產菌CYA4OH 的接合轉移

單孢子懸液制備：菌種培養使用MS培養基，加水從斜面上洗下孢子。將斜面孢子打散、過濾、分裝，用2×YT培養基洗滌1次，重懸于500μL 2×YT培養基中，50℃熱激15min。每次反應孢子用量約2×108個。

接合轉移：將大腸桿菌 ET12567（pUZ8002，pZMW－tsr）在LB培養基（卡那霉素25μg·mL－1，氯霉素25μg·mL－1，安普霉素25μg·mL－1）中37℃培養到對數生長期。取50mL菌液離心濃縮，用LB培養基洗滌2次，重懸于5mL LB培養基中。取500 μL懸液至單孢子懸液中，混勻，涂布于MS固體培養基上，30℃培養18h后，加蓋安普霉素（25μg·mL－1）、硫鏈絲菌素（25μg·mL－1）和萘啶酮酸（25 μg·mL－1），30℃培養13d后檢測生長的單菌落。

1.5 轉基因菌株的培養

將CYA4OH轉基因單菌落接種于ISP2斜面培養基，待長出豐滿孢子后接種于種子培養基中，30℃培養44～48h。

1.6 轉基因菌株的PCR鑒定

收集菌絲，用生理鹽水洗2遍，取適量菌體液氮研磨。研磨好的菌體粉末按Easy－DNA試劑盒說明書提取基因組DNA。以CYA4OH基因組為模板，擴增體系及反應條件同步驟1.3，同時以載體pZM作陽性對照。

2 結果與討論

2.1 pZMW質粒在CYA4OH宿主菌中表達tsr

為了檢驗pZMW是否能夠通過接合轉移在CYA4OH中表達外源基因，選擇較易觀察轉化結果的tsr抗性基因作報告基因。用PCR方法從pZM質粒上擴增tsr抗性基因的編碼序列，并克隆于pZMW質粒的NdeⅠ和PacⅠ位點，構建了質粒pZMW－tsr。將pZMW－tsr轉入大腸桿菌 ET12567（pUZ8002），再通過接合轉移的方法將其轉入CYA4OH菌。結果表明，轉化菌能夠在含安普霉素與硫鏈絲菌素的培養基上生長，表明pZMW已經轉入宿主菌CYA4OH中，且PermE啟動子能在菌中表達外源基因tsr。

2.2 鑒定表達質粒在CYA4OH染色體上的整合

將2株CYA4OH轉化菌接入含25μg·mL－1硫鏈絲菌素的種子培養基，30℃培養48h后，提取基因組DNA。以提取的DNA為模板，用tsr抗性基因編碼序列引物tsr1、tsr2進行PCR擴增。結果表明，PCR產物大小與tsr編碼基因大小完全一致（圖1），表明質粒pZMW在CYA4OH菌中是整合到染色體上的。

圖1 轉化菌CYA4OH（pZMW－tsr）的PCR鑒定Fig.1 PCR Identification of CYA4OH（pZMW－tsr）

2.3 討論

野野村菌將CyA底物羥基化早有報道；CyA衍生物的傳統化學合成法轉化效率不高，產物不特異；采用微生物轉化的方式可以高效地將CyA底物轉化為其4－羥基衍生物，且轉化過程更加環保[3，6］。

為了研究CyA衍生物生產菌CYA4OH的轉化機制并對其進行基因工程改造，有必要建立其DNA轉移系統。建立宿主自身的基因轉移系統是基因鑒定、分析和其它遺傳操作的前提。接合轉移與通常使用的原生質體轉化方法相比，是一種操作簡單又高效的方法。本研究成功地將pZMW通過接合轉移轉入到稀有放線菌野野村菌CYA4OH中，并驗證了外源基因在菌體中的表達，為建立其遺傳操作體系進行了有意義的探索。

3 結論

將染色體整合型糖多孢紅霉菌表達載體pZMW－tsr轉入大腸桿菌ET12567（pUZ8002），以其作為供體，采用接合轉移的方法將硫鏈絲菌素抗性基因tsr轉入4－羥基環孢菌素A衍生物[γHyMeLeu4］CyA生產菌野野村菌CYA4OH中。PCR結果表明，基因已經整合到CYA4OH基因組上。研究表明pZMW載體能夠在稀有放線菌野野村菌中有效表達外源基因。

[1]Kahan B D.Cyclosporin A：A new advance in transplantation[J］.Tex Heart Inst J，1982，9（3）：253－266.

[2]季新燕，溫耀明，陳振偉，等.環孢素的生物學活性及其衍生物的研究進展[J］.國外醫藥：抗生素分冊，2006，27（3）：116－121.

[3]Park N S，Myeong J S，Park H J，et al.Characterization and culture optimization of regiospecific cyclosporin hydroxylation in rare actinomycetes species[J］.J Microbiol Biotechnol，2005，15（1）：188－191.

[4]張部昌，李凌凌，于秀琴，等.糖多孢紅霉素表達載體pZMW的構建[J］.軍事醫學科學院院刊，2003，27（3）：176－179.

[5]張部昌，劉祚軍，曹孟嬋，等.糖多孢紅霉菌多拷貝表達載體pZM的構建[J］.中國生物工程雜志，2004，24（5）：43－46.

[6]Kuhnt M，Bitsch F，France J，et al.Microbial biotransformation products of cyclosporin A[J］.J Antibiot，1996，49（8）：781－787.