重組人胰島素樣生長因子－1工程菌發酵培養基的優化

楊 漸，陳 理，俞昌喜

（福建醫科大學藥學院藥理學系，福建 福州350001）

人 胰 島 素 樣 生 長 因 子－1（Human insulin like growth factor－1，hIGF－1）在生理活動中與神經細胞分化、個體發育、新陳代謝等密切相關［1，2］，對許多疾病具有潛在的臨床治療作用［3－5］，因此外源性 hIGF－1產品具有較大的市場需求。利用基因重組技術制備hIGF－1是目前國內外研究的熱點，要實現重組hIGF－1的大規模制備，高密度發酵是不可缺少的工藝步驟。高密度發酵技術即高密度細胞培養技術（High cell density cultivation，HCDC）能夠顯著增大菌體密度、縮短生產周期，從而降低生產成本、提高生產效率［6］。

要實現工程菌的高密度生長及重組hIGF－1的高效表達，首先需要合適的、能夠滿足表達需要的發酵培養基。實驗室中常用的培養基如LB、M9、MBL等成分相對單一，要用于高密度培養還需要對其組成尤其是碳源、氮源及其比例進行進一步的優化［7］。作者在此以M9培養基為初始發酵培養基，在單因素實驗基礎上，利用正交實驗［8，9］優化適合于表達重組hIGF－1大腸桿菌高密度發酵培養基，以期為后續的大量生產奠定基礎。

1 實驗

1．1 菌種與培養基

表 達 hIGF－1 的 工 程 菌 E．coli DH5α／pET32a（IGF－1），自行構建并保存。

LB培養基（g·L－1）：胰蛋白胨10．0，酵母提取物5．0，NaCl 10．0，pH 值7．0。使用前加入氨芐青霉素至50μg·mL－1。

M9培養基（g·L－1）：NH4Cl 1．0，KH2PO43．0，Na2HPO46．0，葡萄糖4．0，MgSO40．12，pH 值7．0。使用前加入氨芐青霉素至50μg·mL－1。

1．2 方法

1．2．1 工程菌的搖瓶培養

在前期工作［10，11］基礎上，將凍存的工程菌株復蘇后鋪平板，37℃下培養24h；挑取單菌落接種于5mL LB培養基中，37℃、250r·min－1下振蕩12h后，按1∶100比例轉種于發酵培養基，繼續振蕩8h，加入誘導劑誘導6h。

1．2．2 培養基優化方法

在M9培養基的基礎上，首先采用單因素實驗研究不同碳源（葡萄糖、甘油、蔗糖、檸檬酸）及不同氮源（胰蛋白胨、牛肉膏、氯化銨）對工程菌生長與產酸的影響；然后以菌體生長量（OD600）和重組蛋白表達率的乘積為綜合評價指標，采用正交實驗，考察碳氮源配比和5種 無 機 鹽 （Na2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、NaCl、MgSO4）對工程菌生長的影響。實驗均重復3次，結果取平均值。

1．2．3 分析檢測

1．2．3．1 菌體密度測定

采用比色法測定菌體密度：將培養液稀釋適當倍數至光吸收值在0．3～0．7之間，用分光光度計測OD600，測得值與稀釋倍數的乘積即為所測的菌體密度OD600值。

1．2．3．2 重組hIGF－1表達測定

采用蛋白質聚丙烯酰胺凝膠電泳技術，將發酵液離心去上清，用等體積的PBS洗滌并離心去上清2次，所有樣品加入等體積蛋白電泳上樣緩沖溶液，混勻，100℃下加熱3min，離心5min，取上清10μL上樣電泳，考馬斯亮藍法染色，采用凝膠分析軟件Band－Scan 5．0分析重組hIGF－1蛋白的表達量。

2 結果與討論

高密度發酵培養基的優化常在初始培養基的基礎上添加能促進細胞生長及代謝產物形成的不同物質［12］。不同工程菌菌株或是含有不同目的基因的相同菌株對營養物質，特別是碳氮源配比的需求也不盡相同。

2．1 碳源對工程菌生長及產酸的影響

培養基中的碳源既是構成菌體細胞和代謝產物的主要元素，又為微生物生命活動提供能量，且某些碳源代謝過程中產生的有機酸的積累不利于外源蛋白在M9培養基中的表達［13］。葡萄糖、甘油、蔗糖及檸檬酸等4種碳源對工程菌E．coli DH5α／pET32a（IGF－1）生長和產酸的影響見圖1。

圖1 不同碳源對E．coli DH5α／pET32a（IGF－1）生長（a）和產酸（b）的影響Fig．1 Effect of different carbon sources on growth（a）and acid－producing（b）of E．coli DH5α／pET32a（IGF－1）

由圖1可看出，蔗糖或檸檬酸不利于工程菌生長，菌體密度OD600都比較低；以甘油為碳源時，工程菌生長較好，且菌體密度OD600與培養基pH值并不隨甘油濃度的變化而有明顯改變；以葡萄糖為碳源時，隨其濃度的增加，OD600先升后降，在葡萄糖濃度為0．8%時達到最高，發酵液的pH值則明顯下降。

究其原因，一方面，葡萄糖極易被微生物利用而在一定范圍內促進工程菌生長；另一方面，當培養基中的葡萄糖超過了細菌有氧代謝的能力時，過量的葡萄糖進入糖酵解途徑，產生酸性代謝副產物丙酮酸，抑制了工程菌的生長［14］，因此，在以葡萄糖作為碳源發酵時，其濃度應控制在一定范圍內。相對而言，工程菌對甘油的利用較慢，甘油作為碳源也不易產生酸性代謝副產物［15］，因此，菌體密度OD600與培養基pH值相對較為穩定。綜合考慮，選擇葡萄糖和甘油作為優化培養基的碳源。

2．2 氮源對工程菌生長的影響

氮源是菌體合成細胞結構和含氮代謝物的主要原料，可分為無機氮源與有機氮源。無機氮源如氯化銨、硫酸銨等作用持續時間短，能夠被微生物快速利用，并且通常會顯著改變培養基的pH值而影響菌體的生長；胰蛋白胨和酵母粉等有機氮源主要以大分子蛋白質的形式存在，需進一步降解成小分子的肽和氨基酸后才被微生物吸收利用，其利用速度較慢［16］。

不同氮源對工程菌E．coli DH5α／pET32a（IGF－1）生長的影響見圖2。

圖2 不同氮源對E．coli DH5α／pET32a（IGF－1）生長的影響Fig．2 Effect of different nitrogen sources on growth of E．coli DH5α／pET32a（IGF－1）

由圖2可看出，酵母粉和胰蛋白胨均能較好地促進工程菌生長，濃度在6．0%時OD600均達到高峰，但隨其濃度進一步增大，工程菌生長受到抑制；牛肉膏對工程菌生長有促進作用但相對較弱；低濃度的氯化銨有利于菌體生長，但隨其濃度增大，OD600顯著下降。綜合考慮，選擇酵母粉和胰蛋白胨作為優化培養基的氮源。

2．3 培養基碳氮源配比的優化

在確定了合適的碳源和氮源后，需要進一步優化碳氮源配比。碳氮源配比偏小，菌體在發酵早期生長過快，造成菌體提前衰老自溶；碳氮源配比偏大，菌體繁殖數量少、不利于產物的積累，產率下降［17］。因此在確定以葡萄糖、甘油為復合碳源，以酵母粉、胰蛋白胨為復合氮源的基礎上，進行4因素3水平培養基碳氮源配比優化正交實驗，結果見表1，各實驗組的重組hIGF－1蛋白表達情況見圖3。

表1 培養基碳氮源配比優化正交實驗結果與分析Tab．1 Results and analysis of orthogonal experiment for optimization of proportion of carbon source and nitrogen source

由表1可知，葡萄糖濃度對工程菌生長的影響最大，0．4%的葡萄糖對工程菌的生長最為有利，這與單因素實驗結果有所不同，可能是因為培養基中存在的另一種碳源甘油減少了工程菌對葡萄糖的需求；甘油濃度對工程菌生長影響不大，高濃度的甘油（3．0%）也不會抑制工程菌的生長；3%的酵母粉即適合于工程菌生長；而6%的胰蛋白胨對工程菌生長最為有利，但在3%時已基本能滿足工程菌需要，增大濃度對進一步促進工程菌生長十分有限（極差值很?。?。綜合考慮菌體生長量、重組蛋白表達率及發酵成本，確定最佳碳氮源配比為 A1B2C1D1，即葡萄糖0．4%、甘油1．5%、酵母粉3%、胰蛋白胨3%。

2．4 培養基無機鹽的優化

培養基中的無機鹽既是菌體內某些復雜化合物的重要組成部分，又參與酶活性的調節，如Na＋、K＋、Ca2＋、Mg2＋、P3＋等離子可以多種形式存在于培養基中。選擇5種無機鹽（Na2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、NaCl、MgSO4）進行5因素4水平培養基無機鹽優化正交實驗，結果見表2，各實驗組的重組hIGF－1蛋白表達情況見圖4。

圖3 碳氮源配比優化正交實驗中的各組重組hIGF－1的表達Fig．3 Expression of recombinant hIGF－1of each group in the orthogonal experiment for optimization of proportion of carbon source and nitrogen source

由表2可知，對工程菌生長影響較大的無機鹽主要是磷酸鹽Na2HPO4與KH2PO4，其最佳濃度分別為1．2%與0．6%，其余3種無機鹽對工程菌生長影響不明顯（極差值較小）。最適合工程菌E．coli DH5α／pET32a（IGF－1）生 長 的 無 機 鹽 組 合 為：Na2HPO41．2%、KH2PO40．6%、NH4Cl 0．1%、NaCl 0．20%、MgSO40．048%。

表2培養基無機鹽優化正交實驗結果與分析Tab．2 Results and analysis of orthogonal experiment for optimization of inorganic salts

圖4 在無機鹽優化正交實驗中的各組重組hIGF－1的表達Fig．4 Expression of recombinant hIGF－1of each group in the orthogonal experiment for optimization of inorganic salts

2．5 工程菌在優化培養基中的生長曲線

經培養基碳氮源配比及無機鹽的優化，可知適合工程菌E．coli DH5α／pET32a（IGF－1）生長的優化培養基為：葡萄糖0．4%、甘油1．5%、酵母粉3%、胰蛋白胨3%、Na2HPO41．2%、KH2PO40．6%、NH4Cl 0．1%、NaCl 0．20%、MgSO40．048%。工程菌在此優化培養基中的生長曲線如圖5所示。

由圖5可看出，在優化培養基中，搖瓶培養菌體密度OD600最高達7．5，較初始培養基的一般水平有了很大提高。

3 結論

在M9培養基基礎上，通過單因素實驗和正交實驗，優化得到了適合于工程菌E．coli DH5α／pET32a（IGF－1）生長的發酵培養基：葡萄糖0．4%、甘油1．5%、酵母粉3%、胰蛋白胨3%、Na2HPO41．2%、KH2PO40．6%、NH4Cl 0．1%、NaCl 0．20%、MgSO40．048%，在此培養基中搖瓶培養14h，菌體密度OD600達7．5。當然，高密度發酵影響因素眾多，要進一步提高重組hIGF－1的表達水平并實現其在工程菌高密度發酵培養基中的高效表達，還需要對培養條件如誘導劑濃度、誘導時機、誘導時長等進行進一步的優化。

圖5 E．coli DH5α／pET32a（IGF－1）在優化培養基中的生長曲線Fig．5 Cell growth curve of E．coli DH5α／pET32a（IGF－1）in the optimal medium

［1］Backeljauw P，Bang P，Dunger D B，et al．Insulin－like growth factor－I in growth and metabolism［J］．Journal of Pediatric Endocrinology ＆ Metabolism，2010，23（1－2）：3－16．

［2］Nindl B C．Insulin－like growth factor－I，physical activity，and control of cellular anabolism［J］．Medicine and Science in Sports and Exercise，2010，42（1）：35－38．

［3］Bang P．Principles of growth hormone and insulin－like growth factor－I treatment in children with idiopathic short stature［J］．Horm Res Paediatr，2011，76（3）：24－26．

［4］Clemmons D R．Metabolic actions of insulin－like growth factor－I in normal physiology and diabetes［J］．Endocrinol Metab Clin North Am，2012，41（2）：425－443．

［5］Emel E，Ergun S S，Kotan D，et al．Effects of insulin－like growth factor－I and platelet－rich plasma on sciatic nerve crush injury in a rat model［J］．Journal of Neurosurgery，2011，114（2）：522－528．

［6］羅大珍，林稚蘭．現代微生物發酵及技術教程［M］．北京：北京大學出版社，2006：165．

［7］周世寧，劉玉煥，陸勇軍，等．現代微生物生物技術［M］．北京：高等教育出版社，2007：207．

［8］潘明豐，郭美錦，儲炬，等．多殺菌素種子培養基及發酵培養基的優化［J］．中國抗生素雜志，2012，37（10）：745－751．

［9］Sauddagar P S，Singhal R S．Optimization of nutritional requirements and feeding strategies for clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus［J］．Bioresour Technol，2007，98（10）：2010－2017．

［10］廖聯明，楊漸，俞昌喜，等．人胰島素樣生長因子－1的原核表達和純化［J］．中國生化藥物雜志，2009，30（4）：226－229．

［11］楊漸，俞昌喜，廖聯明，等．乳糖誘導人胰島素樣生長因子－1在大腸桿菌中的表達［J］．海峽藥學，2010，22（8）：248－252．

［12］馬曉娟，蔚萍，妙亮，等．可溶型非融合血管生長抑制因子Kringle 5基因工程菌發酵培養和誘導表達條件的優化［J］．化學與生物工程，2012，29（4）：27－31．

［13］Tseng C L，Leng C H．Influence of medium components on the expression of recombinant lipoproteins in Escherichia coli［J］．Appl Microbiol Biotechnol，2012，93（4）：1539－1552．

［14］Mostovenko E，Deelder A M，Palmblad M．Protein expression dynamics during Escherichia coli glucose－lactose diauxie［J］．BMC Microbiology，2011，11：126．

［15］Nikel P I，Pettinari M J，Ramirez M C，et al．Escherichia coli arcA mutants：Metabolic profile characterization of microaerobic cultures using glycerol as a carbon source［J］．J Mol Microbiol Biotechnol，2008，15（1）：48－54．

［16］Collins J G，Dijkstra P，Hart S C，et al．Nitrogen source influences natural abundance15N of Escherichia coli［J］．FEMS Microbiol Lett，2008，282（2）：246－250．

［17］Chen G，Strevett K A．Impact of carbon and nitrogen conditions on E．coli surface thermodynamics［J］．Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2003，28（2－3）：135－146．