7－氯－9－苯基－3，4－二氫吖啶－1（2 H）－酮的合成及其與牛血清白蛋白的相互作用研究

楊緒紅，胡大為，王曉東，劉 穎，於 智

（湖北科技學院核技術(shù)與化學生物學院，湖北 咸寧437100）

吖啶酮類化合物是一類具有良好生物活性的氮雜環(huán)化合物，具有殺菌、消炎、鎮(zhèn)痛和抗癌等作用［1，2］。7－氯－9－苯基－3，4－二氫吖啶－1（2 H）－酮（Y）是含有吖啶酮藥效團的化合物之一，同時由于其羰基的鄰位含有α－H，可以與其它藥物基團進行分子對接，因此也是進一步合成新藥物的優(yōu)良中間體。

作者參照文獻［3］，以5－氯－2－氨基二苯甲酮與1，3－環(huán)己二酮在碘催化下合成7－氯－9－苯基－3，4－二氫吖啶－1（2 H）－酮（Y）。通過IR、1HNMR、13CNMR、MS及元素分析對其結(jié)構(gòu)進行了確證；并用熒光猝滅法在模擬人體生理條件下研究 7－氯－9－苯基－3，4－二氫吖啶－1（2 H）－酮與牛血清白蛋白（BSA）的相互作用，得出兩者相互作用的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)及熱力學參數(shù)，擬為該類物質(zhì)的合成及生物活性研究提供理論依據(jù)。7－氯－9－苯基－3，4－二氫吖啶－1（2 H）－酮的合成路線見圖1。

圖1 7－氯－9－苯基－3，4－二氫吖啶－1（2 H）－酮的合成路線Fig．1 The synthetic route of 7－chloro－9－phenyl－3，4－dihydroacridin－1（2 H）－one

1 實驗

1．1 試劑與儀器

5－氯－2－氨基二苯甲酮；1，3－環(huán)己二酮；牛血清白蛋白（BSA）；三羥基甲氧基氨基甲烷（Tris試劑）；其它試劑均為分析純；實驗用水為二次蒸餾水。

Shimadzu IRPrestige－21 型 紅 外 光 譜 儀；JEOL－500MHz型核磁共振儀；VarioELⅢ型元素分析儀；HP5988A型質(zhì)譜儀；YRT－3型熔點儀（溫度計未經(jīng)校正）；JA5003型電子天平；F－4500型熒光光度計（帶恒溫系統(tǒng)）；PH－3C型酸度計；CS501型超級恒溫器。

1．2 方法

1．2．1 7－氯－9－苯基－3，4－二氫吖啶－1（2 H）－酮的合成

在50mL圓底燒瓶中加入1．1575g（5mmol）5－氯－2－氨基二苯甲酮、0．8338g（7．5mmol）1，3－環(huán)己二酮、10mL無水乙醇、0．0127g碘，在恒溫35℃條件下磁力攪拌反應12h，減壓脫除溶劑，將所得固體用無水乙醇重結(jié)晶，即得黃色產(chǎn)物，產(chǎn)率80%，熔點184～185℃。

1．2．2 7－氯－9－苯基－3，4－二氫吖啶－1（2 H）－酮與 BSA相互作用的研究

參照文獻［4］分別配制5．0×10－5mol·L－1BSA溶液及2．0×10－3mo1·L－17－氯－9－苯基－3，4－二氫吖啶－1（2 H）－酮溶液，于0～4 ℃保存。在模擬人體生理條件下（pH＝7．4），固定BSA的量，激發(fā)波長為295 nm，測定 7－氯－9－苯 基－3，4－二 氫 吖 啶－1（2 H）－酮－BSA（Y－BSA）體系的熒光光譜，考察7－氯－9－苯基－3，4－二氫吖啶－1（2 H）－酮對BSA 的熒光猝滅情況；然后測定不同溫 度 下 7－氯－9－苯 基－3，4－二 氫 吖 啶－1（2 H）－酮 對BSA的熒光猝滅情況，以確定熒光猝滅機理；最后計算7－氯－9－苯基－3，4－二氫吖啶－1（2 H）－酮與 BSA 相互作用的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)及熱力學參數(shù)，確定作用力類型。

2 結(jié)果與討論

2．1 產(chǎn)物結(jié)構(gòu)表征

通過IR、1HNMR、13CNMR、MS及元素分析對產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進行確證。

1HNMR（CDCl3，500MHz），δ：8．0061～7．9877（d，J＝9．2Hz，1H），7．6991～7．1529（m，7H），3．3726～3．3474（t，J1＝6．3MHz，J2＝6．4MHz），2．7233～2．7107（t，J1＝6．3MHz，J2＝6．85MHz），2．2641～2．2515（d，J＝6．3MHz）；13CNMR（CDCl3，125MHz），δ：197．86，162．26，150．61，147．12，136．95，132．71，132．51，130．27，128．45，128．01，127．99，126．84，124．52，77．42，77．17，76．92，40．70，34．63，21．36；IR（KBr），ν，cm－1：3068，3022，2953，1700，1601，1473，1385；MS（ESI），m／z：308（［M＋H］＋）；C19H14NOCl元素分析實測值（理論值）：C 74．15（74．08），H 4．58（4．75），N 4．55（4．51）。所有數(shù)據(jù)解析均與目標化合物結(jié)構(gòu)相符，證明成功合成了7－氯－9－苯基－3，4－二氫吖啶－1（2 H）－酮。

2．2 7－氯－9－苯基－3，4－二氫吖啶－1（2 H）－酮對 BSA 熒光光譜的影響（圖2）

圖2 7－氯－9－苯基－3，4－二氫吖啶－1（2 H）－酮對BSA熒光光譜的影響Fig．2 The fluorescence spectra of BSA in the presence of 7－chloro－9－phenyl－3，4－dihydroacridin－1（2 H）－one

由圖2可知，BSA在375nm附近有較強的熒光峰，隨著體系中7－氯－9－苯基－3，4－二氫吖啶－1（2 H）－酮濃度的增大，BSA的內(nèi)源熒光強度有規(guī)律地降低，而峰的形狀保持不變，說明7－氯－9－苯基－3，4－二氫吖啶－1（2 H）－酮對 BSA 的熒光有猝滅作用。

2．3 熒光猝滅機理

熒光猝滅過程分動態(tài)猝滅過程與靜態(tài)猝滅過程。動態(tài)猝滅過程中隨溫度的升高猝滅常數(shù)相應增大，靜態(tài)猝滅過程中隨溫度的升高猝滅常數(shù)相應減小［5，6］。熒光猝滅遵循Stern－Volmer方程［7，8］，即：

測定溫度分別為298K、302K、306K、310K時7－氯－9－苯基－3，4－二氫吖啶－1（2 H）－酮對 BSA 的熒光猝滅情況，繪制Stern－Volmer曲線，見圖3。

圖3 不同溫度下，Y－BSA體系的Stern－Volmer曲線Fig．3 The Stern－Volmer plots of Y－BSA system at different temperatures

根據(jù)式（1）計算pH＝7．4時不同溫度下的猝滅常數(shù)KSV，見表1。

表1 不同溫度下的猝滅常數(shù)KSV／×105 L·mol－1Tab．1 The quenching constant KSVat different temperatures／×105 L·mol－1

由表1可知，隨著溫度的升高，KSV減小，表明7－氯－9－苯基－3，4－二氫吖啶－1（2 H）－酮對 BSA 的熒光猝滅過程為靜態(tài)猝滅過程。

2．4 結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點數(shù)

7－氯－9－苯基－3，4－二氫吖啶－1（2 H）－酮與 BSA 的表觀結(jié)合常數(shù)Kb和結(jié)合位點數(shù)n根據(jù)式（2）計算［9］：

繪制不同溫度下的lg［（F0－F）／F］～lg［Y］曲線，見圖4。

圖4 不同溫度下，Y－BSA體系的lg［（F0－F）／F］～lg［Y］曲線Fig．4 The lg［（F0－F）／F］～lg［Y］plots of Y－BSA system at different temperatures

依直線的斜率和截距求得化合物7－氯－9－苯基－3，4－二氫吖啶－1（2 H）－酮與 BSA 的表觀結(jié)合常數(shù) Kb和結(jié)合位點數(shù)n，見表2。

表2 結(jié)合常數(shù)Kb和結(jié)合位點數(shù)nTab．2The binding constant Kband the binding site n

由表2可知，在298K、302K、306K、310K下的平均結(jié)合常數(shù)為3．9044×104L·mol－1，結(jié)合位點數(shù)約為1，表明7－氯－9－苯基－3，4－二氫吖啶－1（2 H）－酮分子與BSA分子以1∶1結(jié)合。

2．5 作用力類型

蛋白質(zhì)與小分子之間的作用力類型可根據(jù)反應前后熱力學常數(shù)焓變（ΔH）和熵變（ΔS）的正負來判斷：ΔS＞0、ΔH＞0時，為疏水作用力；ΔS＜0、ΔH＜0時，為氫鍵和范德華力；ΔS＞0、ΔH≈0時，為靜電引力［10－12］。熱力學參數(shù)可根據(jù)式（3）、式（4）計算：

繪制 Van′t Hoff曲線（lnK～1／T 曲線），見圖5。

不同溫度下的熱力學參數(shù)ΔH、ΔG、ΔS見表3。

由表3可知，ΔH＞0、ΔS＞0，表明7－氯－9－苯基－3，4－二氫吖啶－1（2 H）－酮與BSA的作用力類型主要是疏水作用力。

3 結(jié)論

圖5 Van′t Hoff曲線Fig．5 The Van′t Hoff plot

表3 不同溫度下7－氯－9－苯基－3，4－二氫吖啶－1（2 H）－酮與BSA作用的熱力學參數(shù)Tab．3 The thermodynamic parameters for the interaction between 7－chloro－9－phenyl－3，4－dihydroacridin－1（2 H）－one and BSA at different temperatures

7－氯－9－苯基－3，4－二氫吖啶－1（2 H）－酮對牛血清白蛋白（BSA）具有良好的靜態(tài)猝滅作用，其相互作用的結(jié)合常數(shù)為3．9044×104L·mol－1，結(jié)合位點數(shù)約為1，主要作用力類型為疏水作用力。

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