響應曲面法優化刺山柑水溶性多糖提取工藝及其抗氧化性能研究

陳燕勤，陳德軍，張 玲，李 祥

（1．新疆農業大學化學工程學院，新疆 烏魯木齊830052；2．新疆大學化學化工學院，新疆 烏魯木齊830046）

刺山柑（Capparis spinosa L．）為白花菜科山柑屬植物，又名野西瓜、老鼠瓜、槌果藤、瓜兒菜或抗旱草，維吾爾語稱“波里克果”或“卡盤”等。刺山柑原產于地中海地區，現常見于法國南部、意大利和阿爾及利亞等地區，在我國主要分布于新疆、甘肅、西藏等地的荒漠戈壁和低山坡石質沙土地處。刺山柑是維吾爾醫藥常用藥材，其果實中含有黃酮、多糖、生物堿以及揮發性脂肪酸等多類有效成分，具有清除體內異常體液、消腫止痛、祛風、散寒、除濕、暢通阻滯等功效，臨床主要用于痛風、風濕性關節炎等骨關節疾病的治療。在土耳其、印度及中東地區，刺山柑作為一種傳統草藥用于滋補、抗炎、降血壓、降血糖、化痰、驅蟲、利尿、通便等［1－3］。

從天然產物中提取的多糖能參與體內細胞中的各種活動，具有重要的特殊生理活性，在提高人體免疫力、抗氧化、抑制癌細胞、降血糖、抗感染、抗凝血、調血脂等方面都表現出顯著的藥理作用與藥用功效［4－7］。植物多糖的傳統提取方法為加熱煮沸法，該方法耗時較長，且有效成分容易損失。超聲波輔助提取植物多糖具有提取效率高、耗時短、溶劑用量少、活性組分損失小等優點，近年來受到人們的關注［8－10］，但關于刺山柑水溶性多糖的超聲提取研究鮮有報道。

作者在單因素實驗的基礎上，應用響應曲面法對刺山柑水溶性多糖的超聲輔助提取工藝進行優化，同時考察提取的刺山柑水溶性多糖的抗氧化性能，擬為刺山柑的進一步開發利用提供參考。

1 實驗

1．1 材料、試劑與儀器

刺山柑（Capparis spinosa L．）果實，產自新疆吐魯番。

無水乙醇、丙酮、乙醚，天津市化學試劑三廠；石油醚（沸程60～90℃）、水楊酸、七水合硫酸亞鐵、過氧化氫，天津福晨化學試劑廠；苯酚、濃硫酸，天津科盟化工工貿有限公司；葡萄糖，上海山浦化工有限公司；氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、鄰苯三酚，天津光復化學研究所。所用試劑均為分析純。

TU1810型紫外可見分光光度計，北京普析通用有限責任公司；KQ－400KDE型超聲波清洗器，昆山舒美超聲儀器有限公司；DHG－9101A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海齊欣科學儀器有限公司；RE－52A型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；SHB（Ⅲ）型循環水式真空泵，鄭州長城科工貿有限公司。

1．2 方法

1．2．1 預處理

將制干刺山柑果實用重物碾碎過篩（10＃篩，方孔2．0mm），用濾紙包住，放入索氏提取器中，用電熱套加熱回流，先用95%乙醇回流至無色，再用石油醚回流3h，除去色素及脂類物質，然后將刺山柑粉末烘干備用。

1．2．2 刺山柑水溶性多糖超聲輔助提取工藝

流程：刺山柑粉末→蒸餾水超聲提取→過濾→離心→減壓濃縮→去蛋白→離心→洗滌沉淀→干燥→粗多糖。

具體操作：取經過預處理的刺山柑粉末4．0g，加入100mL蒸餾水，在80℃超聲輔助提取85min，合并濾液減壓濃縮至適當體積，用Sevage法除去蛋白質，離心，取上清液減壓濃縮，得刺山柑水溶性多糖糖漿，依次用乙醇、乙醚、丙酮淋洗，真空干燥，得刺山柑水溶性粗多糖。

1．2．3 刺山柑水溶性多糖含量及提取率的測定

多糖含量的測定采用苯酚－硫酸法［11］。準確移取一定濃度刺山柑水溶性粗多糖溶液1mL，分別加入1mL 6%苯酚和5mL濃硫酸，沸水浴5min后立即冷卻，在波長495nm處測定吸光度。以葡萄糖含量（x）為橫坐標、吸光度（y）為縱坐標繪制標準曲線，回歸方程為：y＝0．0726x＋0．1321（R2＝0．9911），據此測得刺山柑水溶性多糖的含量，依下式計算提取率：

1．2．4 刺山柑水溶性多糖提取單因素實驗設計

在保持其它條件不變的情況下，分別考察提取溫度、提取時間和液料比［V（蒸餾水）∶m（刺山柑粉末），mL∶g，下同］3個因素對刺山柑水溶性多糖提取率的影響。單因素實驗的因素與水平如表1所示。

表1 單因素實驗因素和水平Tab．1Factors and levels of single factor experiment

1．2．5 刺山柑水溶性多糖提取的響應曲面法優化實驗設計

選取提取溫度（℃）、提取時間（min）、液料比（mL∶g）為影響因素，應用Box－Behnken的中心組合方法設計3因素3水平實驗。利用 Design Expert 7．1．6軟件對實驗結果進行數據處理和回歸分析。Box－Behnken實驗的因素和水平見表2。

表2 Box－Behnken實驗因素和水平Tab．2Factors and levels of Box－Behnken experiment

1．2．6 刺山柑水溶性多糖抗氧化性能研究

1．2．6．1 對羥基自由基（·OH）清除作用的測定

在試管中依次加入0．5mL 9mmol·L－1水楊酸－乙醇溶液、9mmol·L－1Fe2＋溶液（現配）、0．5mL不同濃度的待測樣品和3．5mL蒸餾水，最后加入5 mL 8．8mmol·L－1H2O2使體系發生 Fenton反應，反應一定時間后搖勻，在波長510nm處測定吸光度A1。重復測定3次，取平均值。多糖樣品對羥基自由基的清除率（K）按下式計算：

式中：A1為加入Fe2＋溶液的吸光度；A2為加入蒸餾水代替Fe2＋溶液的吸光度；A3為加入蒸餾水代替待測樣品的吸光度。

1．2．6．2 對超氧陰離子自由基（·O－2）清除作用的測定

采用鄰苯三酚自氧化法測定。取100μL不同濃度的待測樣品與4．5mL 10mmol·L－1PBS緩沖溶液（pH值8．3）混合，將混合液在25℃下恒溫15min，取出3mL加入到100μL 45mmol·L－1鄰苯三酚溶液中，反復振蕩3min后，在波長420nm處測定吸光度A′1。重復測定3次，取平均值。多糖樣品對超氧陰離子自由基的清除率（K′）按下式計算：

2 結果與討論

2．1 單因素實驗結果與分析

2．1．1 提取溫度對刺山柑水溶性多糖提取率的影響（圖1）

BOTDR是布里淵散射光時域反射測量技術(Brillouin Optical Time Domain Reflectometry)的縮寫，是一種分布式應變監測技術，屬于滑坡地表位移測線型監測技術。其基本原理是利用光纖中的自然布里淵散射光的頻移變化量與光纖所受的軸向應變和溫度的線性關系，得到光纖的軸向應變，進而求出軸向位移[21]，根據BOTDR接收到的布里淵散射光頻率，即可完成光纖上各點的定位和測量。布里淵散射光頻率的漂移量與光纖的軸向應變和溫度的關系與可用下式表示：

圖1 提取溫度對多糖提取率的影響Fig．1 Effect of extraction temperature on polysaccharides extraction rate

由圖1可以看出，刺山柑水溶性多糖提取率隨提取溫度的升高逐漸上升，這是由于溫度升高使得多糖分子的動能增加、擴散作用加強，提取率上升；當溫度為80℃時，提取率達到最大值；隨著溫度的繼續升高，提取率有下降趨勢，這可能是由于高溫對水溶性多糖的結構和活性有影響，使得水溶性多糖加速降解，從而導致提取率下降。因此，在響應曲面法的中心組合實驗中選擇70℃、80℃和90℃作為提取溫度的3個水平參數。

2．1．2 提取時間對刺山柑水溶性多糖提取率的影響（圖2）

圖2 提取時間對多糖提取率的影響Fig．2 Effect of extraction time on polysaccharides extraction rate

由圖2可以看出，刺山柑水溶性多糖提取率隨提取時間的延長逐漸上升，在提取85min之后升幅趨緩，可能是由于提取一定時間后溶液體系滲透壓趨于平衡所致。因此，在響應曲面法的中心組合實驗中選擇80min、85min和90min作為提取時間的3個水平參數。

2．1．3 液料比對刺山柑水溶性多糖提取率的影響（圖3）

由圖3可以看出，刺山柑水溶性多糖提取率隨液料比的增大逐漸上升，這主要是因為增加水量使得多糖的溶出率增大；當液料比達25∶1之后，由于溶液體系滲透壓趨于平衡，提取率基本保持不變。因此，在響應曲面法的中心組合實驗中選擇20∶1、25∶1和30∶1作為液料比的3個水平參數。

圖3 液料比對多糖提取率的影響Fig．3 Effect of liquid－solid ratio on polysaccharides extraction rate

2．2 響應曲面優化實驗結果與分析

2．2．1 模型方程的建立及實驗結果

在單因素實驗的基礎上，采用Box－Behnken中心組合法，設計刺山柑水溶性多糖的超聲輔助提取工藝優化實驗［12］。通過最小二乘法擬合出該實驗模型的二次多項式方程：

式中：R1為預測響應值（刺山柑水溶性多糖提取率）；β0為常數項；βi為線性系數；βii為二次項系數；βij為交互項系數；xi、xj（i≠j）為自變量編碼值。

表3 Box－Behnken實驗設計及結果Tab．3Design and result of Box－Behnken experiment

2．2．2 模型的顯著性檢驗

根據方程（1），采用 Design Expert 7．1．6軟件對表3的數據進行模擬回歸分析，得到二次多項式回歸方程：

對該回歸模型進行方差分析，結果見表4。對該回歸模型系數顯著性進行檢驗，結果見表5。

表4回歸模型的方差分析Tab．4 Variance analysis of regression model

由表4可以看出，該實驗所選模型的P值小于0．0001，說明模型的顯著性為極其顯著，符合實驗的要求。模型失擬項的P值為0．7619，顯著性判定為沒有顯著性意義，說明實驗設計中沒有異常實驗，模型的回歸方程不需要引入更高次數的項。模型校正后的復相關系數為0．9798，表明模型的響應值（多糖提取率）中97．98%的變化來自于所選變量，實驗變量的選擇在響應值影響的范圍內。方差分析表明模型與實驗的擬合情況較好，可以用于分析和預測刺山柑水溶性多糖超聲輔助提取工藝的優化［13］。

由表5可以看出，模型的一次項A、B、C的P值均小于0．01，說明實驗選擇的影響因素的3個水平對刺山柑水溶性多糖提取率的影響顯著，即實驗選擇的條件范圍符合刺山柑水溶性多糖提取工藝條件選擇的需要。模型的二次項A2、C2的P值小于0．01，說明提取溫度和液料比對多糖提取率的影響較為顯著，這與單因素實驗結果吻合。對于模型的交互項來說，BC的P值小于0．05，說明提取時間和液料比之間有一定的交互作用，在選擇刺山柑水溶性多糖的提取工藝條件時要考慮兩者之間的關系。

通過上述分析，對模型中影響不夠顯著的項進行優化，得到修正后的刺山柑水溶性多糖提取率（R1）對提取溫度（A）、提取時間（B）和液料比（C）的二次多項式回歸方程為：

2．2．3 響應面分析

根據模型的二次多項式回歸方程，繪制相應的響應面曲線圖和等高線圖，以考察相應因素之間對于結果的交互影響程度的強弱。R1＝f（A，B，C＝25∶1）的響應面及等高線見圖4，R1＝f（A，C，B＝85min）的響應面及等高線見圖5，R1＝f（B，C，A＝80℃）的響應面及等高線見圖6。

在等高線圖中，等高線的形狀可以反映兩種因素對于結果的交互效應的影響，橢圓形表示兩因素交互影響顯著，圓形則相反。由圖4和圖5可以看出，其等高線曲線接近圓形，說明相對應的因素提取溫度與提取時間、提取溫度與液料比之間的交互作用不夠顯著，為較獨立的影響因素。而由圖6可以看出，其等高線曲線接近橢圓形，說明提取時間和液料比兩因素之間交互作用較為顯著，這與回歸模型系數顯著性檢驗結果相吻合。

綜合回歸模型和響應面分析結果，本實驗中各因素對刺山柑水溶性多糖提取率的影響程度依次為：液料比＞提取溫度＞提取時間，其中液料比、提取溫度對提取率影響較大，而提取時間的影響較小。

2．2．4 刺山柑水溶性多糖提取工藝條件模型計算

利用修正后的回歸模型計算得到刺山柑水溶性多糖的最佳提取工藝條件為：提取溫度85．74℃，提取時間88．95min，液料比30∶1，預測最高多糖提取率為8．98%。

2．2．5 模型驗證實驗

為了驗證響應曲面法模型的可靠性，在模型計算得到的優化工藝條件下提取刺山柑水溶性多糖，分別進行3次重復性實驗，刺山柑水溶性多糖的提取率分別為8．92%、8．85%、8．89%，平均值為8．89%。實驗結果與計算結果吻合較好，表明該模型對刺山柑水溶性多糖的提取具有良好的預測性。因此，確定基于響應曲面法優化的刺山柑水溶性多糖超聲輔助提取工藝條件為：提取溫度85℃，提取時間89min，液料比30∶1。

2．3 刺山柑水溶性多糖的抗氧化性能

對提取得到的刺山柑水溶性多糖粗提物進行抗氧化實驗，考察其對羥基自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（·）的清除能力，結果見圖7。

圖7 多糖對羥基自由基（a）和超氧陰離子自由基（b）的清除能力Fig．7 Capability to scavenge hydroxyl free radical（a）and superoxide anion free radical（b）of polysaccharides

由圖7可以看出，刺山柑水溶性多糖對羥基自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（·O）均有一定的清除作用。隨著濃度的增大，刺山柑水溶性多糖對兩種自由基的清除能力明顯升高，當添加濃度為4mg·mL－1時，刺山柑水溶性多糖對羥基自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（·O）的清除率均達到較高水平，分別為67．38%和41．12%。表明，刺山柑水溶性多糖具有一定的抗氧化活性。

3 結論

（1）在單因素實驗的基礎上，利用 Box－Behnken設計、響應曲面法以及 Design Expert 7．1．6 軟件，建立了以刺山柑水溶性多糖提取率為響應值，以提取溫度、提取時間、液料比為影響因子的二次多項式數學模型。根據模型以及驗證實驗最終確定超聲輔助提取刺山柑水溶性多糖的優化工藝條件為：提取溫度85℃、提取時間89min、液料比30∶1（mL∶g），在此條件下平均提取率為8．89%。

（2）采用響應曲面法優化得到的刺山柑水溶性多糖提取工藝科學合理，與實際結果吻合較好，為刺山柑水溶性多糖的提取提供了理論依據。

（3）抗氧化活性研究結果表明，刺山柑水溶性多糖對羥基自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（·O－2）具有一定的清除作用，說明刺山柑水溶性多糖是一種有潛在開發價值的天然抗氧化劑。

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