不同冷凍時間對異體神經移植后生理特性的影響

張 勇，陳德龍，陳小龍，曾希銀，聶春福

（遂寧市第一人民醫院骨科，四川 629000）

異體神經是臨床上修復長段主要神經缺損重要的研究材料。但它最大弊端是免疫排斥［1］，從而影響神經移植后的生理特性。在這方面國內外學者做了大量的基礎研究［2－8］。研究普遍認為：降低異體神經移植免疫排斥的較好方法是超深低溫（－196℃）冷凍保存。那么，究竟保存多長時間才能使移植后的生理特性最佳呢？目前最長研究時間為3周，更長的時間有待進一步探索。本研究的目的就是觀察超深低溫條件下不同冷凍時間對異體神經移植后生理特性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑和器械 甘油（純度大于99.0%，瀘州生物試劑公司）；水合氯醛（純度大于98.0%，瀘州生物試劑公司）；電鏡（JEM－1400，日本電 子株式會社）；光鏡 （Olympus Bx50，蘇州易微光學公司）；顯微手術鏡（XTS－4A，江蘇鎮江中天光學儀器公司）；電生理實驗系統（BL－420F，成都生物設備有限公司）。

1.2 實驗動物及分組 80只雌性Wistar大鼠（重慶醫科大學動物實驗中心提供），質量（280±30）g。取材組20只，其余60只按隨機原則分為對照組（A組：新鮮自體神經移植組；B組：新鮮異體神經移植組，每組10只）和實驗組（按取材組神經在－196℃條件下保存3、6、9、12周后移植分為C、D、E、F組，每組10只。）

1.3 方法

1.3.1 取材 用水合氯醛將Wistar大鼠麻醉后，暴露雙側的坐骨神經，切取神經干1.0cm，總計40根。將取下的神經分4組每組10根放于50%甘油的EP管中，而后在超深低溫條件下按不同冷凍時間進行保存。

1.3.2 神經移植 A組：坐骨神經取下后立即原位移植于自體；B組：坐骨神經取下后立即兩兩交叉移植；C、D、E、F組分別在坐骨神經冷凍保存相應時間后，在常溫下（25℃）用生理鹽水復溫，按隨機原則進行移植。所有組別術后均不用藥物處理。

1.3.3 觀察指標 術后間隔一定時間觀察移植側肢體的情況；術后3、6、9周做神經電生理檢測，術后第9周做光鏡、電鏡觀察。

1.4 統計學處理 結果用SPSS17.0統計軟件進行數據處理，計量資料用表示，各組間采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大體觀察 A組術后第3天大鼠足部輕微腫脹糜爛，術后1周趨于穩定，術后3周腫脹糜爛漸消，移植段表面散在少許毛細血管分布，和周圍組織無黏連。術后6周腫脹糜爛基本消除，移植段神經表面分布大量毛細血管。術后9周腫脹糜爛完全消除，移植段神經表面已形成網狀毛細血管。B組術后第3天足部腫脹糜爛便很明顯，術后1周足趾便開始散在性脫落，術后3周腫脹糜爛范圍加大，程度加深，移植段神經和周圍組織黏連重，神經表面毛細血管稀少。術后6周趨于穩定，移植段神經與周圍組織黏連很嚴重，神經表面只可見少量毛細血管。術后9周糜爛基本修復，移植段神經近遠端被纖維組織包裹，難以分離，神經表面毛細血管依舊稀少。D、C組很接近，稍遜于A組，明顯優于B組。E、F組的效果優于B組，遜于A、C、D組；E組的效果稍好于F組。

2.2 神經電生理 動作電位峰值、神經傳導速度統計分析：移植3周、6周后：A組與B、C、D、E、F組之間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。移植9周后，A組和B、E、F組之間比較差異有統計學意義（P＜0.05）；A組與C、D組之間比較差異無統計學意義（P＞0.05）；C、D組之間比較差異無統計學意義（P＞0.05），這說明坐骨神經組冷凍保存3周、6周后移植，9周后的電生理特性近似于A組，見表1、2。

2.3 光鏡觀察 各組別術后9周取移植神經中段做半薄切片HE染色觀察，結果見圖1。A組：少量軸突腫脹和空泡變性，軸突密度高，施萬細胞大小均一增生明顯，極其少量的淋巴細胞浸潤，新生毛細血管大量生成；B組：空泡變性明顯，大部分軸突水腫，施萬細胞大小不一散在增生，淋巴細胞大范圍、高密度浸潤，少量新生毛細血管；C、D組無明顯差別，整體效果接近于A組；E組差于A、C、D組，優于B、F組，F組優于B組。

圖1 術后9周各組光鏡結果（×200）

圖2 術后9周各組電鏡結果（×12000）

表1 術后3、6、9周各組別動作電位峰值（，n＝5，mV）

表1 術后3、6、9周各組別動作電位峰值（，n＝5，mV）

a：P＜0.05，與A組比較。

組別 3周 6周 9周8.15±0.43 8.93±0.69 9.02±0.78 B組 4.97±0.18 5.29±0.82 5.80±0.32a C組 7.01±0.39 8.13±0.12 8.89±0.69 D組 7.23±0.46 8.21±0.57 8.92±0.44 E組 6.03±0.61 7.17±0.72 7.57±0.52a F組 5.91±0.82 6.81±0.59 7.19±0.39 A組a

表2 術后3、6、9周各組別神經傳導速度（mV，，n＝5）

表2 術后3、6、9周各組別神經傳導速度（mV，，n＝5）

a：P＜0.05，與A組比較。

組別 3周 6周 9周10.24±0.42 12.44±0.17 12.57±0.67 B組 5.22±0.38 5.87±0.41 6.81±0.36a C組 7.69±0.89 9.15±0.38 12.03±0.42 D組 7.93±0.32 9.37±0.22 12.21±0.39 E組 5.96±0.46 7.29±0.42 9.12±0.73a F組 5.68±0.89 7.08±0.56 9.01±0.64 A組a

2.4 電鏡觀察 各組別術后9周取移植神經中段做超薄切片電鏡觀察，結果見圖2。A組：髓鞘外形光滑，發育成熟，有髓或無髓神經纖維大量再生，施萬細胞軸漿均勻、豐富，呈旺盛狀，效果最好。B組：難見神經纖維、施萬細胞、軸突再生，紊亂的結締組織多見，效果最差。C、D組差別不大但稍遜于A組。E、F組明顯差于A、C、D組。

3 討 論

3.1 自體和異體神經移植后生理特性差別的主要原因 通過本實驗可以看出：自體神經移植后生理特性是明顯優于異體神經的。造成其差別的主要原因是免疫排斥的影響。免疫排斥是機體對移植物（異體細胞、組織或器官）通過特異性免疫應答使其遭受破壞的過程。一般是指移植術后，受者可識別移植物抗原并產生應答，移植物中免疫細胞也可識別受者抗原組織并產生應答。在同種異體移植中，排斥反應有兩種基本類型：宿主抗移植物反應（HVGR）和移植物抗宿主反應（GVHR）。免疫排斥反應過程既有細胞介導的又有的抗體介導。異體神經移植后的免疫排斥，主要組織相容性復合體（MHC）起了主要作用［9－10］，它存在于施萬細胞，是主要的抗原成分。此外，神經基底膜管的完整性也會影響神經的再生修復后的生理特性，因為它是神經固有基質框架。因此，最大限度地去除施萬細胞抗原性并保留基底膜管的完整性是優化異體神經移植后生理特性的必要條件。

3.2 冷凍處理法對異體神經移植后生理特性的影響 異體神經經超深低溫冷凍處理后，主要抗原成分被最大限度清除，而且對神經基底膜管的完整性損傷較小，最大程度降低了異體神經移植的免疫排斥性，使異體神經移植后的生理特性得到優化［11－12］。這種兼顧二者的特性使其比化學法［13］、放射輻照法［14］、川芎嗪處理法［15］、綠茶多酚處理法［16］、免疫抑制法［17］顯得更勝一籌。通過本實驗可以看出：冷凍法異體神經處理后，其移植免疫后的生理特性可以得到不同程度的改善，再生效果優于新鮮異體神經移植。

3.3 不同冷凍時間對異體神經移植后生理特性的影響 冷凍法處理異體神經后，雖然可以改善移植后的生理特性，但若保存時間過短，難以清除施萬細胞的抗原成分，排斥反應仍然強烈，生理特性難以達到最佳狀態；反之過長，冰晶會對基底膜管造成機械性和滲透性損傷［18］，也將影響移植后的生理特性。由此可知，異體神經冷凍保存存在一個最佳時間。有研究表明，冷凍保存時間低于3周，異體神經移植后效果明顯遜于新鮮自體神經移植［19］。從本實驗可以看出，冷凍保存時間太長，如9、12周后的移植效果也是明顯次于新鮮自體神經移植的，而保存3周、6周后的移植效果卻和新鮮自體神經移植很接近。由此可知：異體神經移植后的生理特性與冷凍時間存在依存關系。不過，3周到6周之間的冷凍移植效果尚未明確，仍需進一步的探索。

冷凍時間的長短對異體神經移植后的生理特性起了極大的影響作用，找到最佳的保存時間顯得尤為重要。最佳的保存時間不僅可以使異體神經移植后的生理特性達到最優狀態，更能使移植后的恢復效果達到最佳，是極有臨床實用價值和發展前景的。

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