大鼠蛛網膜下腔出血后早期ADAMTS－4的表達與血腦屏障通透性的相關性研究

岳四海，劉獻志，張宏鳳

（鄭州大學第一附屬醫院神經外科／鄭州市神經病學重點實驗室 450000）

動脈瘤性蛛網膜下腔出血是一種具有較高病死率與病殘率的神經外科急癥，近年來大量的基礎及臨床研究表明早期腦損傷（early brain injury，EBI）可能在蛛網膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）后的病理進程中起著重要的作用，這使得近年來人們的注意力開始轉向SAH后的EBI［1］。EBI包含眾多病理機制，其中血腦屏障（blood brain barrier，BBB）的破壞是EBI的重要病理機制之一，而導致BBB破壞的諸多因素中細胞外基質的損傷非常重要［2－3］。ADAMTS－4（a disintegrin－like and metalloproteinase with thrombospondin type l motifs－4）是ADAMTSs家族中一員，是一種新發現的金屬蛋白酶，ADAMTS－4可通過降解細胞外基質參與多種病理生理過程［4］，本研究旨在對ADAMTS－4在SAH后早期腦損傷中的作用進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年雄性SD大鼠72只，體質量250～300 g。大鼠隨機分為對照組和SAH組，其中對照組共12只，6只用于檢測ADAMTS－4mRNA及蛋白表達水平，6只用于血腦屏障通透性檢測，且均于術后72h處死。SAH組（60只），按處死時間6、12、24、48、72h分為5個亞組。

1.2 方法

1.2.1 SAH模型的制作 采用改良的Sheffield大鼠SAH模型［5］，向頸內動脈插入長約5cm前端銳化的3－0尼龍線，SAH組在插入2.0～2.5cm時多感到明顯阻力，克服阻力再插入2mm后，迅速退出尼龍線，恢復頸內動脈血流并結扎頸外動脈殘端，縫合頸部切口，對照組插入尼龍線約1.5～2.0 cm后不再繼續插入。

1.2.2 大鼠海馬組織ADAMTS－1的 Western blotting分析 提取含30μg蛋白的樣品進行十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）凝膠電泳。加入 Anti－ADAMTS－4（1∶1000，Abcam，美國）并4℃孵育過夜，羊抗鼠IgG－HRP（1∶2000，中杉金橋，中國）室溫孵育2h，顯色后由quantityone軟件系統計算ADAMTS－4和β－actin的光密度值，二者比值作為該樣品ADAMTS－1蛋白的表達量。

1.2.3 ADAMTS－4的mRNA的檢測 按Trizol試劑盒說明提取海馬組織總RNA。根據RNA濃度（μg／mL）＝OD206×40μg／mL×稀釋倍數，計算RNA濃度。采用兩步法逆轉錄－PCR（RT－PCR）試劑盒配置反應體系。ADAMTS－4上游引物：5′－GTG AAT ACA CGC TGA TGC C－3′下游引物：5′－AGC CGG GAC AGT GAG GTT－3′擴增片斷為312bp。內參GAPDH 上游引物：5′－GTG CTG AGT ATG TCG TGG AGT CT－3′，下游引物：5′－GTG GAA GAA TGG GAG TTG CTG T－3′擴增片段610bp。RT－PCR產物在2% 瓊脂糖凝膠上電泳，采用quantity－one圖像處理系統分析比較電泳條帶相對光密度值。

1.2.4 腦伊文氏藍（Evans blue，EB）濃度的檢測 經股靜脈注向已麻醉大鼠注射2%EB（5mL／kg），1h后經左心室注入37℃生理鹽水，待流出液清亮后迅速斷頭取腦，置37℃恒溫水浴箱中，48h后離心取上清液，紫外分光光度計波長632nm比色測定吸光度（OD）值，根據標準曲線計算腦組織EB濃度（mg／g腦濕重）。

1.2.5 α2巨球蛋白抑制ADAMTS－4表達在EBI病理過程中的作用 此部分研究共分為3個組，分別為：假手術組、藥物干預組和非干預組，每組各6只SD大鼠，模型制作方法同上，藥物干預組為：術后股靜脈注射ADAMTS－4抑制劑α2巨球蛋白每次120mg，每12小時1次。各組大鼠均于術后48h后處死，分別進行蛋白提取測定及EB濃度檢測，方法同上。比較3組的蛋白表達及EB濃度，進一步檢測ADAMTS－4在SAH后的EBI過程中對血腦屏障的作用。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，計量資料用表示，多組間均數的比較采用單因素方差分析，用LSD－t檢驗比較兩組間的差異，變量之間采用pearson相關分析，檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠海馬組織ADAMTS－4蛋白表達水平變化 SAH后6、12h組與對照組相比差異無統計學意義（P＞0.05）；SAH后24hADAMTS－4蛋白與對照組相比表達顯著增高（P＜0.05）；SAH后72hADAMTS－4蛋白活性仍然維持在較高水平，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1、表1。

圖1 Western blotting檢測各組ADAMTS－4及β－Actin的表達

2.2 大鼠海馬組織ADAMTS－4mRNA表達變化 SAH 后6、12h組大鼠海馬組織ADAMTS－4mRNA表達與對照組相比差異無統計學意義（P＞0.05）；SAH 后24hADAMTS－4 mRNA表達開始增高，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05）；SAH 后48hADAMTS－4mRNA 表達 達到高峰；72h ADAMTS－4mRNA表達較48h開始下降，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2、表1。

2.3 SAH后大鼠血腦屏障通透性改變 SAH后12hEB濃度較對照組開始顯著增加（P＜0.05）；SAH后48hEB濃度最高，72hEB濃度較48h有所降低但仍維持在較高水平，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.4 大鼠海馬ADAMTS－4蛋白表達與腦內EB濃度的相關性 SAH后ADAMTS－4蛋白表達與腦內EB濃度整體呈正相關（r＝0.917，P＜0.05）。

圖2 RT－PCR檢測每組 ADAMTS－4及GAPDH的mRNA的表達

表1 ADAMTS－4mRNA和蛋白的表達變化及大鼠腦內EB濃度的變化（）

表1 ADAMTS－4mRNA和蛋白的表達變化及大鼠腦內EB濃度的變化（）

a：P＜0.05：與SAH后24h相比；b：P＜0.05，與對照組相比。

組別 n mRNA 蛋白濃度 EB 60.197±0.049 0.189±0.041 8.091±0.198 SAH組6h 60.228±0.040a 0.216±0.046a 7.815±0.153a 12h 60.249±0.035a 0.202±0.043a 18.336±0.316b 24h 60.712±0.094b 0.634±0.069b 23.122±0.584b 48h 60.833±0.068b 0.824±0.074b 29.753±0.249b 72h 60.556±0.059b 0.755±0.047b 17.462±0.631濃度對照組b

2.5 α2巨球蛋白干預后ADAMTS－4的蛋白表達及EB濃度的變化 經α2巨球蛋白干預后，SAH后48hADAMTS－4蛋白表達較非干預組明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。且干預組腦內EB濃度較非干預組亦有顯著減少（P＜0.05）。見圖3、表2。

圖3 Western blotting檢測各組ADAMTS－4及β－Actin的表達

表2 ADAMTS－4蛋白的表達變化及大鼠腦內EB濃度的變化

3 討 論

自發性SAH是一種嚴重的神經外科急癥，顱內動脈瘤破裂是自發性SAH的最主要原因［6］。近年來SAH后EBI越來越引起人們的重視，并認為其在SAH后的病理進程中起著重要的作用，EBI指的是SAH后72h以內腦內所發生的病理改變，其包含眾多復雜病理機制，如包括顱內壓升高、腦灌注壓降低、血腦屏障破壞、血管收縮、細胞死亡途徑的激活、壞死、凋亡及自噬性死亡離子穩態的失衡、NO／NOS途徑的活化、氧化應激、炎癥因子釋放等［7－9］，其中BBB的破壞是EBI的重要組成部分，其早期功能障礙促進了腦水腫的發生，而細胞外基質的降解是導致BBB破壞的重要原因［10］。ADAMTS意為含I型血小板結合蛋白基序（TSP）的解聚蛋白樣金屬蛋白酶，是繼基質金屬蛋白酶MMPs后新發現的一類Zn2＋依賴的分泌型金屬蛋白酶，ADAMTS－4的功能是ADAMTSs中研究較為透徹的成員之一，可以特異性降解aggrecan，brivecan和versican［11－13］。目前已知的ADAMTS酶系的調節機制是它可以被金屬蛋白酶抑制劑調節，其中金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）是內源性的，且金屬蛋白酶抑制劑TIMP－3及α2巨球蛋白是ADAMTS－4和－5的重要的抑制劑［17］。有研究顯示在惡性膠質瘤中，ADAMTS－4的表達水平明顯升高，通過降解brivecan，介導了神經膠質瘤的侵襲與轉移［14－15］。Cross等［16］研究顯示早期腦梗死時ADAMTS－4表達上調，并參與破壞了BBB的完整性。但有關SAH后EBI中ADAMTS－4與BBB的關系尚未見報道。

本研究采用改良的血管內穿刺法建立大鼠SAH的動物模型，定量檢測了ADAMTS－4在SAH后72h內多個時間點的表達，同時與之對應的檢測了大鼠腦內EB濃度以衡量其BBB的變化。結果顯示ADAMTS－4的mRNA和蛋白表達高峰均出現在出血后48h，且此時EB濃度亦達到最大值。統計分析證實：SAH后早期大鼠腦內EB濃度與ADAMTS－4蛋白活性呈正相關，提示SAH后大鼠BBB損害可能與ADAMTS－4降解細胞外基質，導致BBB結構破壞有關。隨后通過應用ADAMTS－4抑制劑α2巨球蛋白進行干預，并檢測干預后ADAMTS－4的蛋白表達與腦內EB濃度變化，進一步證實ADAMTS－4可能參與了SAH后BBB的損害這一病理過程。

ADAMTSs底物譜相對基質金屬蛋白酶MMPs選擇性較高、特異性較強，所以進一步深入研究ADAMTS－4在SAH后EBI及整個病理過程中的相關機制，可能為SAH的治療提供新的方向。

［1］Luo C，Yi B，Tao G，et al.Adenosine a3receptor agonist reduces early brain injury in subarachnoid haemorrhage［J］.Neuroreport，2010，21（13）：892－896.

［2］Duris K，Manaenko A，Suzuki H，et al.α7nicotinic acetylcholine receptor agonist PNU－282987attenuates early brain injury in a perforation model of subarachnoid hemorrhage in rats［J］.Stroke，2011，42（12）：3530－3536.

［3］Lee JY，Keep RF，Hua Y，et al.Deferoxamine reduces early brain injury following subarachnoid hemorrhage［J］.Acta Neurochir Suppl，2011，112：101－106.

［4］Haddock G，Cross AK，Plumb J，et al.Expression of ADAMTS－1，－4，－5and TIMP－3in normal and multiple sclerosis CNS white matter［J］.Mult Scler，2006，12（4）：386－396.

［5］Ansar S，Svendgaard NA，Edvinsson L.Neurokinin－1receptor antagonism in a rat model of subarachnoid hemorrhage：prevention of upregulation of contractile ETB and 5－HT1Breceptors and cerebral blood flow reduction［J］.J Neurosurg，2007，106（5）：881－886.

［6］Velat GJ，Kimball MM，Mocco JD，et al.Vasospasm after aneurysmal subarachnoid hemorrhage：review of randomized controlled trials and meta－analyses in the literature［J］.World Neurosurg，2011，76（5）：446－454.

［7］Wan H，Loch Macdonald R.Circulatory and vascular changes after aneurysmal subarachnoid hemorrhage［J］.J Neurosurg Sci，2011，55（4）：329－341.

［8］Sehba FA，Bederson JB.Nitric oxide in early brain injury after subarachnoid hemorrhage［J］.Acta Neurochir Suppl，2011，110（Pt 1）：99－103.

［9］Hasegawa Y，Suzuki H，Sherchan P，et al.Tyrosine phosphatase inhibition attenuates early brain injury after subarachnoid hemorrhage in rats［J］.Acta Neurochir Suppl，2011，110（Pt 1）：67－70.

［10］Loftspring MC.Iron and early brain injury after subarachnoid hemorrhage［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2010，30（11）：1791－1792.

［11］Moncada－Pazos A，Obaya AJ，Viloria CG，et al.The nutraceutical flavonoid luteolin inhibits ADAMTS－4and ADAMTS－5aggrecanase activities［J］.J Mol Med，2011，89（6）：611－619.

［12］Wayne GJ，Deng SJ，Amour A，et al.TIMP－3inhibition of ADAMTS－4（Aggrecanase－1）is modulated by interactions between aggrecan and the C－terminal domain of ADAMTS－4［J］.Biol Chem，2007，282（29）：20991－20998.

［13］Liacini A，Zafarullah M，Induction of ADAMTS－4by interleukin－1：comment on the article by Pratta et al［J］.Arthritis rheum，2004，50（6）：2038－2039.

［14］Tortorella MD，Arner EC，Hills R，et al.Alpha2－macroglobulin is a novel substrate for ADAMTS－4and ADAMTS－5and represents an endogenous inhibitor of these enzymes［J］.Biol Chem，2004，279（17）：17554－17561.

［15］Cudic M，Burstein GD，Fields GB，et al.Analysis of flavonoid－based pharmacophores that inhibit aggrecanases（ADAMTS－4and ADAMTS－5）and matrix metalloproteinases through the use of topologically constrained peptide substrates［J］.Chem Biol Drug Des，2009，74（5）：473－482.

［16］Cross AK，Haddock G，Stock CJ，et al.ADAMTS－1and－4are up－regulated following transient middle cerebral artery occlusion in the rat and their expression is modulated by TNF in cultured astrocytes［J］.Brain Res，2006，1088（1）：19－30.

［17］Glasson SS，Askew R，Sheppard B，et al.Deletion of active ADAMTS5prevents cartilage degradation in a murine model of osteoarthritis［J］.Nature，2005，434（7033）：644－648.