五味子和芍藥提取物對哮喘模型大鼠血清細(xì)胞因子水平的影響＊

陳 霞，唐 軍，馮 靜

（解放軍三二四醫(yī)院兒科，重慶 400020）

五味子和芍藥是小青龍湯中主藥之一，方中五味子和芍藥配伍的獨(dú)特性，加強(qiáng)了止咳平喘的效果。為探討五味子和芍藥治療哮喘的機(jī)理，本文采用五味子和芍藥提取物治療哮喘模型大鼠，通過測定了大鼠血清細(xì)胞因子水平的變化，初步了解兩味中藥對哮喘模型大鼠免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 哮喘模型大鼠的制備及實(shí)驗(yàn)步驟 取4周齡的SD大鼠30只，體質(zhì)量40～50g。SD大鼠購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)所。隨機(jī)分成中藥治療組（A組）及哮喘發(fā)作組（B組）、生理鹽水對照組（C組），各組大鼠10只。A組和B組均給予氫氧化鋁200mg、卵蛋白1mg、生理鹽水0.2mL皮下注射，每2天1次，連續(xù)3次，另間隔給予百日咳桿菌疫苗0.2 mL皮下注射，每2天1次 連續(xù)3次。致敏后給予2%卵蛋白霧化吸入激發(fā)1周，每日1次。C組用等量的生理鹽水代替抗原液皮下注射。觀察A組和B組大鼠出現(xiàn)打噴嚏、抓耳撓腮、呼吸急促，腹肌收縮，煩躁攻擊，脫毛、毛發(fā)稀疏等表現(xiàn)。A組給予中藥提取物每日2mL灌胃治療10d。3組大鼠分別在治療前和治療后10d取血2mL離心靜置待檢。3組均在治療后10d取氣管組織行HE染色觀察。

1.2 方法

1.2.1 儀器和設(shè)備 壓縮霧化器：德國百瑞公司，自制霧化箱50cm×53cm×58cm，自動多功能酶標(biāo)儀：科華公司 KHB ST－360，PT210型電子天平：德國 Sartorius公司，TGL－16G 高速臺式離心機(jī)：中國上海安惠科學(xué)儀器廠，全自動酶標(biāo)洗板機(jī)：沈陽惠氏生物工程有限公司；白介素（IL）4，IL－6、γ干擾素（IFN－γ）、IL－13、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA，Biovalue公司）。

1.2.2 芍藥和五味子提取物制備 兩種藥物以1∶1比例采用乙醇回流提取法，提取的中藥原液置于密閉容器中密閉保存。

1.2.3 IL－4、IL－6、IFN－γ、IL－13測定 采用 ELISA 試劑盒進(jìn)行。按照每孔100μL依次加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測品，37℃孵育60 min后扣干孔內(nèi)液體，依次加入底物和終止液，并在30min內(nèi)使用酶標(biāo)儀在450nm下讀取吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用的SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料用表示。計(jì)數(shù)資料采用率表示。組間差異的顯著性采用方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠氣管病理形態(tài)學(xué)觀察 A組大鼠氣管平滑較完整，柱狀上皮及刷狀緣基本完整，少量淋巴細(xì)胞浸潤。B組大鼠氣管平滑肌層有斷裂，淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞有爭奪，呈重度炎癥反應(yīng)。C組大鼠氣管組織無淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，無纖毛受損表現(xiàn)。見圖1。

2.2 3組大鼠外觀觀察 A組和B組大鼠激發(fā)后相繼出現(xiàn)打噴嚏、抓耳撓腮、呼吸急促，腹肌收縮，煩躁攻擊，脫毛、毛發(fā)稀疏等癥狀，而C組大鼠無明顯改變。給予中藥提取物灌胃治療后，A組大鼠打噴嚏、煩躁攻擊減輕，毛發(fā)恢復(fù)光潤。

2.3 3組細(xì)胞因子水平的變化 IL－4，IL－6、IL－13在 A、B組較C組有明顯升高（P＜0.05），而A、B組治療前和治療后無顯著變化（P＞0.05）。IFN－γ在C組治療前和治療后均高于B組（P＜0.05）；A組治療后與治療前比較有顯著升高（P＜0.05）。見表1。

圖1 各組大鼠氣管病理形態(tài)學(xué)（×40）

表1 3組細(xì)胞因子水平比較（pg／mL，，n＝10）

表1 3組細(xì)胞因子水平比較（pg／mL，，n＝10）

IL－4IL－6IL－13IFN－γ組別±35.22982.27±31.51 B組 144.19±19.31138.76±20.66452.11±47.64433.88±38.55259.65±31.22267.43±25.77498.67±33.87511.69±25.74 C組 82.39±15.7785.96±16.48213.55±22.56205.68±31.74152.66±18.46168.95±27.69752.63±1治療前 治療后A組 147.38±23.05182.94±21.19474.49±52.31402.67±36.33274.58±20.04268.31±25.33503.29治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后5.64765.95±20.11

3 討 論

細(xì)胞因子對哮喘氣道炎癥反應(yīng)和氣道重塑的影響，近年越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。早在1986年 Mosmann等［1］首次提出在氣道炎癥時(shí)，Th2類細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子（如IL－4，IL－13，IL－5）的水平是升高的，而 Th1類細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子（如IFN－γ）會降低，導(dǎo)致Th1／Th2在體內(nèi)失衡。因此增強(qiáng)Th2細(xì)胞的免疫反應(yīng)和相應(yīng)細(xì)胞因子的水平都可導(dǎo)致哮喘和過敏反應(yīng)的發(fā)生［2－3］，而且IL－4還能使IgE的產(chǎn)生增加。研究表明IL－4和IL－13是很關(guān)鍵的Th2細(xì)胞因子，都能作用氣道引起氣道高反應(yīng)性［4］。另外樹突狀細(xì)胞分泌的IL－6在促進(jìn)Th2限制Th1反應(yīng)中起著重要作用，也誘發(fā)了哮喘的發(fā)作［5－6］。因此 Th2主導(dǎo)的免疫反應(yīng)與Th1抑制有關(guān)［7］，即Th1／Th2比例失調(diào)是哮喘的主要病理特征和主要發(fā)病機(jī)制［8］。通過調(diào)節(jié)Th1／Th2細(xì)胞因子比例失衡已成為哮喘免疫治療的主要靶點(diǎn)［9］。我國的傳統(tǒng)中藥在調(diào)節(jié)Th1／Th2細(xì)胞因子比例失衡方面的效果已引起國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，但是組方不同調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子水平也不盡相同［10］。

小青龍湯是中醫(yī)的十大名方之一，出自張仲景的《傷寒論》，在溫化痰飲、宣肺平喘方面有奇效，而芍藥和五味子的應(yīng)用一直被認(rèn)為是此方的經(jīng)典之處。過去常認(rèn)為湯中用芍藥、五味子，其中芍藥酸斂以護(hù)肝陰，五味子酸斂以護(hù)腎陰，斂肺止咳，起增強(qiáng)止咳平喘之功和制約諸藥辛散溫燥太過之弊。本研究通過五味子和芍藥兩種藥物以1∶1配方研究對哮喘模型大鼠的治療作用及血液細(xì)胞因子的變化，可以看出兩種藥物配方治療10d后，哮喘模型大鼠氣管平滑肌逐步修復(fù)，氣管炎癥細(xì)胞的浸潤減少，打噴嚏、呼吸急促，煩躁攻擊，毛發(fā)稀疏等癥狀明顯減輕。血清細(xì)胞因子水平檢測結(jié)果提示哮喘模型形成后，血清IL－4，IL－6、IL－13水平升高，而IFN－γ水平下降；治療組血清IL－4，IL－6、IL－13水平治療前和治療后無明顯變化，而IFN－γ水平治療后10d明顯高于治療前（P＜0.05）。提示兩種藥物主要通過調(diào)節(jié)IFN－γ水平達(dá)到改變Th1／Th2比例失調(diào)作用，而對Th2細(xì)胞因子影響不明顯。這與國內(nèi)有些報(bào)道其他中藥如黃芪、麻杏石甘湯對Th1／Th2兩類細(xì)胞因子均有調(diào)節(jié)不一致［11－13］。至于五味子和芍藥為什么以調(diào)節(jié)IFN－γ水平為主，還需要更多的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步證實(shí)，也對我國的傳統(tǒng)名方提供更多的科學(xué)詮釋。

綜上所述，五味子和芍藥治療哮喘模型大鼠療效確切，血清細(xì)胞因子中以IFN－γ升高為主，機(jī)制尚不清楚還需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確。

［1］Mosmann TR，Cherwinski H，Bond MW，et al.Two types of murine helper T cell clone.I.Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins［J］.J Immunol，1986，136（7）：2348－2357.

［2］尹靜，黃永富.炎性細(xì)胞因子在支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用［J］.國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，32（10）：1087－1089.

［3］Guo CH，Chen PC，Hsia S，et al.The relationship of plasma aluminum to oxidant－antioxidant and inflammation status in asthma patients.Envitron Toxicol Pharmacol［J］，2013，35（1），30－38.

［4］Woodruff PG，Modrek B，Choy DF，et al.T－h(huán)elper type 2－driven inflammation defines major subphenotypes of asthma［J］.Am J Respir Crit Care Med，2009，180（5）：388－395.

［5］Richter C，Thieme S，Bandola J，et al.Generation of inducible immortalized dendritic cells with proper immune function in vitro and in vivo［J］.PLOS One，2013，8（4）：e62621.

［6］Rincon M，Irvin CG.Role of IL－6in asthma and other inflammatory pulmonary diseases［J］.Int J Biol Sci，2012，8（9）：1281－1290.

［7］Ngoc PL，Gold DR，Tzianabos AO，et al.Cytokines，allergy，and asthma ［J］.Curr Opin Allergy Clin Immunol，2005，5（2）：161－166.

［8］鐘婕，陳勝利，許博，等.免疫狀態(tài)及Th1／Th2型細(xì)胞因子在支氣管哮喘患兒治療前后的變化［J］.海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，18（12）：1695－1697.

［9］Schuijs MJ，Willart MA，Hammad H，et al.Cytokine targets in airway inflammation［J］.Curr Opin Pharmacol.2013，13（3）：351－361.

［10］袁穎，金素安，何世民.中藥對Th1／Th2細(xì)胞因子平衡調(diào)節(jié)作用的研究進(jìn)展［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2011，45（5）：90－93.

［11］裘燕飛，王偉軍.黃芪對哮喘患兒外周血Th1／Th2平衡的影響［J］.福建中醫(yī)藥，2012，43（1）：25－26.

［12］黎同明，朱章志，王桂香.不同配比麻杏甘石湯對哮喘大鼠Th1／Th2類細(xì)胞因子分泌的影響 ［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13（8）：200－203.

［13］楊仁旭，代平，彭波，等.麻杏芎葶合劑對哮喘模型大鼠氣道炎癥的調(diào)控作用［J］.中醫(yī)雜志，2012，53（21）：1847－1851.