人皮膚鱗狀細胞癌體外三維模型的建立及高侵襲性鱗癌細胞的生物學評價＊

楊曉鯤，楊亞東，楊桂紅，唐書謙，伍津津

（第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所皮膚科，重慶 400042）

人皮膚鱗狀細胞癌（the human shin squamous－celled carcinoma，SCC），是皮膚腫瘤中侵襲性、致死性較強的一類，對其研究一直都是熱點。以往研究者借助普通的二維細胞培養和鱗癌動物模型進行研究，本試驗中，通過建立SCC三維培養模型，并進一步篩選出具有更高侵襲性的SCC細胞亞群，并比較兩種細胞亞群之間的生物學特性，為臨床治療SCC提供重要的理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 1～3個月雄性裸鼠40只，由第三軍醫大學大坪醫院動物實驗所提供。

1.1.2 細胞和試劑 人表皮鱗癌細胞株A－431細胞株（TCHu188，上海細胞生物研究所），人源角質形成細胞（KC細胞）和成纖維細胞（FB細胞）為本實驗室常規凍存備用，鼠尾膠原按本科方法制備［1］；肉桂醛（Sigma公司）；注射用重組人干擾素α1b（IFNα1b）（賽若金，每支1mL∶30μg，國藥準字S10960059，深圳科興生物工程有限公司）；層粘連蛋白，普通和高糖DMEM 培養基（Hyclone公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT粉）、表皮生長因子、殼多糖、硫酸軟骨素C、透明質酸（均為SIGMA產品），HEPES（美國KAI生物醫學科學公司），膠原酶D（德國寶靈曼公司）；胰蛋白酶（中國科學院新疆化學研究所）。

1.1.3 主要儀器設備 超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司），二氧化碳孵箱TC2323型（SHEL LAB公司），HY－4調速多用振蕩器（江蘇金壇市中大儀器廠）；酶標儀（Biotek ELx800，USA）；細胞計數儀（HK97CASY－TT）。

1.2 方法

1.2.1 A431細胞及相關細胞的培養和傳代 向A431細胞的培養瓶中加入2mL 0.01mol／L的磷酸鹽緩沖液（PBS），清洗2次，倒掉培養基，加入0.25%胰酶4℃冷消化30min，后輕輕拍打培養瓶壁，加入1mL胎牛血清終止消化后按1∶2～1∶4傳代擴增，以此獲得的A431細胞記為Ⅰ組。KC細胞和FB細胞從臨床健康成人包皮標本獲取，并常規培養、傳代。

1.2.2 建立A431鱗癌細胞三維培養模型 參照以往研究［1］在6孔培養板上制作組織工程凝膠，將FB 1.5×105個細胞／孔混入凝膠中，待凝膠凝固后，再按照A4310.5×105個細胞／孔、KC 2×105個細胞／孔的比例加入凝膠中，進行A431三維培養模型的建立，分為 A、B、C、D組（分別對應5、7、10、14d），各重復2組（一組觀察鱗癌細胞浸潤情況，另一組消化提取細胞）。為改善培養環境，利用振蕩器進行振蕩培養；并在5、7、10、14d取出標本，甲醛液固定，常規HE染色，鏡下觀察A431細胞浸潤情況。之后將D組表皮層中細胞去除，加入2%膠原酶D消化，獲得浸入真皮層的A431細胞，培養傳代后，再次按前述各細胞數量接種于組織工程凝膠中，并分為a、b、c、d組，可再次重復2組，以獲取侵襲特性更強的鱗癌細胞，并將此A431細胞記為Ⅱ組（普通培養A431細胞為Ⅰ組）。

1.2.3 肉桂醛溶液、IFNα1b溶液及0.5%MTT液的配制肉桂醛溶液配制以0.2%二甲基亞砜溶液作為溶劑，將肉桂醛溶液和高糖無血清DMEM培養基經過避光振蕩5min，0.22μm 濾膜過濾，分別配制成100μL的100、200、400μmol／L 3種 濃度，于 4℃ 保存備用。IFNα1b溶 液 配制：30μg／mL IFNα1b用無血清DMEM作為稀釋劑，分別稀釋成3、2、1μg／mL濃度并置于4℃保存備用。0.5%MTT液配制：將50mg MTT混合于10mL的0.01M磷酸鹽緩沖液中，振搖、溶解，0.22μm濾膜過濾，并于4℃保存備用。

1.2.4 MTT法測定A431細胞增殖 取對數期生長的A431細胞，無菌PBS洗滌3次后0.25%胰酶消化，觀察細胞收縮變圓后終止消化。1200r／min離心5min，棄上清液，加入完全培養基重懸，細胞計數儀計數，按2×104個細胞／100微升接種于96孔板，每孔100μL，置入37℃，5%CO2孵箱培養。待細胞貼壁后分別加入肉桂醛0、100、200、400μmol／L（對應配制好的肉桂醛溶液加入量分別為0.0、12.5、25.0、50.0μL）。每組5復孔（n＝5），置入孵箱繼續培養。分別在培養24、48和72h后每孔加入5g／L的MTT溶液20μL，繼續培養4h，每孔加入二甲基亞砜150μL，避光振蕩10min，酶標儀490nm處測量光密度值。

1.2.5 裸鼠成瘤模型的建立及不同侵襲性A431細胞成瘤活性的比較 按接種A431細胞的不同分為Ⅰ、Ⅱ組，并按照接種后裸鼠生長時間分為3、4、5、6周組，每組5只，胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，用無血清培養液洗滌3次，3000r／min離心3min，棄上清液。加PBS液稀釋，制成單細胞懸液用于細胞計數，調整細胞濃度為2×106／mL，裸鼠背部皮膚用75%乙醇進行消毒，以1mL注射器吸取0.1mL細胞懸液，數量為2×106個，注射入裸鼠背部皮下組織，注射完畢后觀察裸鼠，無異樣反應，繼續放于無菌飼養房內飼養，并觀察腫瘤生長情況，并在一定時間內脫頸法處死裸鼠，留取腫瘤標本，后用體積公式：V＝0.5×a×b2，（a為長徑，b為短徑）計算腫瘤體積。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件進行統計分析，計量資料用表示，細胞增殖抑制率等采用χ2檢驗，組間比較采用t檢驗，檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 A431鱗癌細胞三維培養模型的建立 由圖1可觀察到，作者建立的組織工程皮膚表真皮分化明顯，形成較之普通傳統培養形式不同的三維立體結構，以標志性的基底膜為界，上為組織工程皮膚表皮部分，而下為組織工程的真皮凝膠部分，并且從三維培養的第5天開始，組織工程皮膚真皮凝膠層中可見到核異型性明顯的腫瘤細胞浸潤，并且隨著時間的延長，浸潤入真皮層內的細胞數量明顯增加，同時腫瘤浸潤的廣度和深度都有所增加，到第14天時達到高峰。結果提示鱗癌細胞三維培養模型建立成功。

圖1 各組A431鱗癌細胞組織學觀察（HE×10）

表1 不同濃度肉桂醛對Ⅰ組、Ⅱ組A431細胞增殖的抑制率（%，，n＝20）

表1 不同濃度肉桂醛對Ⅰ組、Ⅱ組A431細胞增殖的抑制率（%，，n＝20）

aP＜0.01，與無藥物對照組比較；b：P＜0.01，與100μmol／L比較；c：P＜0.01，與200μmol／L比較。

濃度（μmol／L）24hⅠ組 Ⅱ組48hⅠ組 Ⅱ組72hⅠ組 Ⅱ組0000000100 13.15±2.12a 18.53±1.71a 21.67±1.53a 24.56±2.32aa 28.35±4.61a 35.51±4.93a 200 26.75±3.53ab 32.27±2.61ab 32.76±3.53ab 40.46±5.52ab 47.65±7.24ab 59.21±5.24ab 400 44.35±3.44abc 56.45±4.22abc 65.21±5.02abc 76.65±3.54abc 73.45±3.55abc 85.65±4.31abc

表2 不同濃度IFNα1b對Ⅰ組、Ⅱ組A431細胞增殖的抑制率（%，，n＝20）

表2 不同濃度IFNα1b對Ⅰ組、Ⅱ組A431細胞增殖的抑制率（%，，n＝20）

a：P＜0.01，與無藥物對照組比較；b：P＜0.01，與100μmol／L比較；c：P＜0.01，與200μmol／L比較。

濃度（μmol／L）24hⅠ組 Ⅱ組48hⅠ組 Ⅱ組72hⅠ組 Ⅱ組0000000100 19.75±3.16a 26.50±2.30a 23.65±7.12a 29.94±6.24a 31.65±3.23a 37.33±4.49a 200 23.46±2.17ab 31.46±3.27ab 28.45±3.52ab 34.65±3.38ab 36.45±4.26ab 40.38±3.99ab 400 27.76±3.24abc 38.34±4.25abc 37.86±2.15abc 45.25±4.65abc 45.35±6.26abc 51.65±2.37abc

2.2 肉桂醛和IFNα1b對不同侵襲性的A431細胞增殖活性的影響 隨著肉桂醛、IFNα1b濃度的增加，鱗癌細胞被抑制率也隨之增高，且Ⅰ組、Ⅱ組間對比，差異有統計學意義（P＜0.01），見表1。隨著藥物濃度的增加，鱗癌細胞被抑制率也隨之增高，且Ⅰ組、Ⅱ組間對比，差異有統計學意義（P＜0.01），見表2。接種后，Ⅱ組裸鼠形成的腫瘤較Ⅰ組體積更大，質量更重，差異有統計學意義（P＜0.01），見表3。

表3 兩組A431細胞成瘤活性的比較（，n＝20）

表3 兩組A431細胞成瘤活性的比較（，n＝20）

a：P＜0.01，與Ⅰ組比較。

體積（mm3）組別3周 4周 5周 6周腫瘤質量（g）Ⅰ組393±41 598±53 798±711553±1275.38±0.58Ⅱ組 379±36a 522±66a 701±82a1123±105a3.05±0.37a

3 討 論

SCC在皮膚腫瘤中發生率較高，對于它的治療方法和基礎研究很多，本實驗中，運用SCC A431細胞建立了SCC體外三維培養模型，并篩選出侵襲性更強的A431細胞亞群，并將這兩類細胞的生物學特性做了比較，證明了鱗癌細胞三維培養模型的有效性，為今后SCC的臨床治療和科研研究提供良好的體外培養模型。

眾所周知，目前腫瘤研究的主要手段集中于腫瘤細胞的二維培養、動物荷瘤模型和自發性動物腫瘤模型等方面，都存在著明顯的局限性，與臨床腫瘤診治往往存在偏差［2－3］。而三維培養，有利于種植細胞固有的生物學特性的維持［4］，可以較為真實地再現體環境中細胞與細胞、細胞與細胞外基質相互間的作用。目前，已經在腫瘤形態發生、侵襲性生長及化療藥物的藥理毒理的研究中提供了比較有價值的研究手段［5－6］。例如，有學者將乳腺癌（SUM1315、MDA－MB－231）、前列腺癌（LNCaP）細胞株種植于聚已酸內酯磷鹽三鈣（mPCL－TCP）、聚甲基丙稀酸－2－羥乙酯（polyHEMA）、Matrigel等支架材料中，并在三維培養條件下形成腫瘤團塊［7－8］，并維持了惡性腫瘤的生物學特性［9－10］。

在本次實驗中，利用復方殼多糖真皮基質凝膠這一三維培養支架為基礎，本研究成功地建立了SCC體外三維培養模型，這與目前腫瘤侵襲性研究采用的細胞侵襲測定裝置系統如CytoSelect系統［11］、聚碳酸酯濾器穿壁系統［12］相比，具有明顯的優勢，可以真實反映在體情況下腫瘤突破表皮層而進入真皮層的失衡過程，同時能夠獲得這一類鱗癌細胞亞群。經過肉桂醛和IFNα1b對皮膚鱗癌細胞的增殖抑制實驗發現，隨著藥物濃度的增加，鱗癌細胞被抑制率也隨之增高，差異有統計學意義（P＜0.01），其中肉桂醛在濃度為400μmol／L、作用時間為72h時，對兩組細胞的抑制率分別達到（85.65±4.31）%和（73.45±3.55）%。而IFNα1b在濃度為400μmol／L、作用時間為72h時，對兩組細胞的抑制率則分別達到了（51.65±2.37）%和（45.35±6.26）%，同時這兩組實驗分組細胞之間比較，相同濃度藥物和相同藥物作用時間對腫瘤細胞的增殖抑制差異有統計學意義（P＜0.01）。另外，兩種不同侵襲特性的細胞亞群的成瘤特性差異有統計學意義（P＜0.01）。

綜上所述，本研究體外構建鱗癌細胞三維培養模型是成功的，通過此模型，也能夠篩選出侵襲性更強的鱗癌細胞，這對構建其他皮膚惡性腫瘤的三維培養模型、治療藥物篩選與評價都有重要的理論和實驗指導價值。至于如何維持此種腫瘤三維培養模型的穩定性，以及本次研究中的皮膚鱗癌細胞侵入真皮層的具體機制，需要在今后的實驗工作中繼續探討。

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