共染MIP－1α與B7－1誘導乳腺癌大鼠免疫應答能力的研究

梁莉萍，賈存東

（新疆醫科大學附屬腫瘤醫院：1.病理科；2.腫瘤內科，烏魯木齊 830011）

乳腺癌是女性中常見的惡性腫瘤，且發病率隨著社會的發展而趨向增長［1－2］。對于乳腺癌的治療手段多樣，大大提高了患者的生存率，但其病死率仍較高，尤其是對于乳腺癌晚期及遠處轉移的患者，普通的治療手段往往效果難以令人滿意［3－4］。隨著醫療相關學科及技術的發展，基因治療引起了各學者的重視［5］。目前，關于乳腺癌基因治療的研究仍較少，因此，筆者通過動物實驗探討共轉染 MIP－1α與B7－1基因對乳腺癌大鼠免疫效應應答的影響，為臨床對乳腺癌患者實施基因治療提供一個初步的基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SPF級環境下飼養的SD雌性大鼠40只，體質量25～30g，7～10d；源性乳腺癌細胞株SHZ－88及經逆轉錄或（和）培育的SHZ－88親代細胞、SHZ－88／MIP－1α細胞、SHZ－88／B7－1細胞及SHZ－88／MIP－1α＋B7－1細胞。

1.2 研究方法

1.2.1 乳腺癌大鼠造模及成瘤實驗 采用SHZ－88乳腺癌細胞建立乳腺癌大鼠模型40只，觀察模型的穩定性；將實驗動物按照接種細胞的不同分成對照組（接種SHZ－88親代細胞）、MIP－1α組（接種 SHZ－88／MIP－1α細胞）、B7－1組（接種 SHZ－88／B7－1細胞）及聯合組（接種SHZ－88／MIP－1α＋B7－1細胞），每組10只，觀察接種后有無腫瘤生長。

1.2.2 轉基因細胞對乳腺癌大鼠的治療方法 各細胞均經絲裂霉素C滅活，濃度為2.5×107／mL，1周注射1次，每次0.2 mL，共治療2次。治療完成2周后取一半大鼠的外周血檢測CD4＋、CD8＋百分比和CD4＋／CD8＋比值以及白細胞介素2（IL－2）、人γ干擾素（IFN－γ）水平，另一半大鼠用于觀察腫瘤體積變化以及生存時間。

1.2.3 觀察指標 計算注射轉基因腫瘤細胞后乳腺癌大鼠腫瘤體積分別在第1周、第2周、第3周及第4周的大小；記錄實驗大鼠的生存時間，計算每組的平均值；采用流式細胞術檢測大鼠外周血CD4＋、CD8＋百分比和CD4＋／CD8＋比值；使用酶聯免疫吸附試驗法檢測大鼠外周血的IL－2、IFN－γ水平。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0建立數據庫并對數據進行處理分析，計數資料采用的形式表示，組間差異采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 SD大鼠造模及成瘤結果 采用SHZ－88細胞建立的乳腺癌大鼠模型均成功且穩定，致瘤率達到100%，且腫瘤體積隨著時間的延長不斷增大。在腫瘤細胞接種10d后，采用SHZ－88親代細胞接種，成瘤性達到100%；采用SHZ－88／MIP－1α接種，成瘤性降低到20%；采用SHZ－88／B7－1接種，成瘤性降低到30%；而采用SHZ－88／MIP－1α＋ B7－1接種則成瘤性消失且保持無瘤狀100d以上。

2.2 乳腺癌大鼠腫瘤體積的變化 注射轉基因腫瘤細胞的荷瘤大鼠的腫瘤體積在1～4周均較對照組小，差異有統計學意義（P＜0.05）；而在第2周、第3周及第4周，聯合組荷瘤大鼠的腫瘤體積均明顯小于MIP－1α組及B7－1組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 乳腺癌大鼠腫瘤體積的變化（cm3，，n＝10）

表1 乳腺癌大鼠腫瘤體積的變化（cm3，，n＝10）

a：P＜0.05，與對照組比較；b：P＜0.05，與聯合組比較。

組別 1周 2周 3周 4周0.89±0.113.26±0.198.05±0.5453.38±2.49 MIP－1α組 0.85±0.08a1.30±0.11ab 3.53±0.33ab 8.22±0.52ab B7－1組 0.86±0.12a1.39±0.13ab 3.84±0.38ab 9.31±0.44ab聯合組 0.82±0.14a1.03±0.10a1.64±0.29a5.48±0.47對照組a

2.3 荷瘤大鼠外周血T淋巴細胞亞型百分比比較 MIP－1α組、B7－1組及聯合組外周血T淋巴細胞亞型CD4＋、CD8＋的百分比與CD4＋／CD8＋均較對照組高（P＜0.05）；且聯合組明顯高于 MIP－1α組及B7－1組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 荷瘤大鼠外周血T淋巴細胞亞型百分比的比較（，n＝10）

表2 荷瘤大鼠外周血T淋巴細胞亞型百分比的比較（，n＝10）

a：P＜0.05，與對照組比較；b：P＜0.05，與聯合組比較。

組別 CD4＋（%） CD8＋（%） CD4＋／36.29±1.03 13.19±0.89 2.19±0.20 MIP－1α組 40.80±1.71ab 15.81±1.29ab 2.79±0.09ab B7－1組 40.79±1.28ab 16.41±1.04ab 2.71±0.14ab聯合組 44.28±4.10a 19.81±1.91a 3.08±0.23 CD8＋對照組a

表3 荷瘤大鼠生存天數、外周血IL－2及IFN－γ水平的比較（，n＝10）

表3 荷瘤大鼠生存天數、外周血IL－2及IFN－γ水平的比較（，n＝10）

a：P＜0.05，與對照組比較；b：P＜0.05，與聯合組比較。

組別 生存天數（d） IL－2（pg／mL） IFN－γ（pg／mL）53.39±1.15 9.17±1.02 24.27±2.23 MIP－1α組 63.79±1.62ab 11.40±1.20ab 33.09±2.29ab B7－1組 64.19±1.91ab 11.47±1.24ab 33.20±2.22ab聯合組 89.01±2.54a16.77±1.33a 58.06±3.35對照組a

2.4 荷瘤大鼠的生存天數、外周血IL－2及IFN－γ水平比較MIP－1α組、B7－1組及聯合組荷瘤大鼠的生存天數均明顯多于對照組（P＜0.05）；且聯合組較 MIP－1α組及B7－1組明顯延長，差異有統計學意義（P＜0.05）。MIP－1α組、B7－1組及聯合組大鼠外周血的IL－2及IFN－γ水平均明顯高于對照組（P＜0.05）；且聯合組的水平明顯高于 MIP－1α組及B7－1組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討 論

腫瘤患者存在不同程度的免疫抑制［6－7］，且隨腫瘤負荷的增大而越趨明顯，導致腫瘤局部未能顯現出有效的抗腫瘤免疫應答［8］。因此，嘗試提高免疫效應細胞的數量及質量，激發機體產生抗腫瘤免疫應答，增強腫瘤局部免疫原性，逆轉免疫抑制狀態，可達到治療腫瘤的效果。

MIP－1α主要生物功能有［9－10］：管理炎性反應；參與 T 淋巴細胞免疫反應；增強單核、巨噬細胞、T淋巴細胞與內皮細胞的黏附性；誘導各種炎性介質的產生等。腫瘤細胞往往缺乏B7分子的共刺激作用，未能有效激活T細胞，使得腫瘤細胞未能被機體免疫系統攻擊［11］。轉染B7－1分子，促進第二信號系統作用，激活T細胞效應，可產生抗腫瘤作用［11－12］。本實驗結果顯示在乳腺癌大鼠模型內接種轉染MIP－1α與B7－1細胞后，成瘤性消失且保持無瘤狀態超過100d，荷瘤大鼠生存時間明顯長于轉染單基因及親代腫瘤細胞大鼠?？梢娹D染 MIP－1α與B7－1能夠提高腫瘤局部有效的免疫效應細胞數量及質量，提高腫瘤的免疫原性，激發強烈的抗腫瘤作用。

T淋巴細胞介導的細胞免疫是抗腫瘤免疫效應機制的最主要部分，其主要元素是激活狀態下的T細胞CD4＋及CD8＋2個亞型，加以CD4＋／CD8＋可作為反映機體免疫功能狀態的指標［13］。CD4＋細胞參與巨噬細胞、B細胞、NK細胞等的激活，還可分泌各種細胞因子，從而起到抗腫瘤的作用［14］。CD8＋細胞對腫瘤細胞具有一定的殺傷作用且不傷害正常細胞［15］。細胞因子中以IL－2及IFN－γ在抗腫瘤效應中起主要作用［16－17］。因此，本研究通過測定CD4＋、CD8＋、CD4＋／CD8＋及IL－2、IFN－γ水平來評價荷瘤大鼠接種轉基因細胞后的抗腫瘤免疫效應。結果顯示，共轉染MIP－1α與B7－1細胞的荷瘤大鼠外周血CD4＋、CD8＋百分比和CD4＋／CD8＋比值以及IL－2、IFN－γ水平均明顯高于對照組及轉染單基因的大鼠，可見共轉染 MIP－1α與B7－1后，能明顯提高機體的免疫效應，大大提高抗腫瘤作用。

本實驗表明，協同 MIP－1α與B7－1的不同作用原理及機制，能增強對乳腺癌大鼠的抗腫瘤作用，療效明顯優于單基因治療，可為日后進一步的實驗研究提供初步的參考。

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