影響果膠鈣凝膠形成的因素以及果膠鈣凝膠應用*

黃雪松，郭秀君

(暨南大學理工學院食品科學與工程系，廣東 廣州，510632)

果膠鈣凝膠是果膠分子中的游離羧基陰離子與鈣離子結合而形成的凝膠［1］。該凝膠常以含水凝膠或干燥固體的形式存在于植物組織中，現已逐漸將其應用于微生物固定化、果膠生產、食品、藥品等領域。由于果膠鈣凝膠的形成、性質與應用受果膠的化學結構、理化性質和環境等因素的影響，因此，深入分析形成果膠鈣凝膠的影響因素有助于解決果膠鈣凝膠應用中存在的問題。本文重點綜述影響果膠鈣凝膠形成的因素與果膠鈣凝膠的應用。

1 果膠鈣凝膠的形態與安全性

果膠溶液，尤其是低甲氧基果膠(酯化度＜50%)溶液，在偏堿性條件下，其游離羧基帶負電，常常與環境中的游離鈣離子結合形成果膠鈣凝膠，該凝膠的鈣含量、凝膠強度、剛性、黏彈性、透性、含水量等特征因形成的條件而異。如果去掉水分，就成為干燥狀態的果膠鈣。

大量研究證實，食用果膠鈣凝膠是安全的。1977年美國生命科學研究所就提出果膠和果膠酸鹽添加劑具有保健功能，在果膠或果膠酸分子中引入鈣離子并不改變其食用安全性。Borzelleca 等人進而通過毒理學實驗證明了果膠鈣對人體健康沒有危害，是GRAS(公認安全無害)物質［2］，該結果為果膠鈣在醫藥、微生物、酶、食品等領域的安全使用奠定了基礎。

2 果膠鈣凝膠的化學結構

單純的果膠鈣凝膠或干燥的果膠鈣，不溶于水或其他溶劑，因此其分子質量、形狀、譜學特點等分子結構特征的資料報道較少。人們主要還是通過果膠的分子結構了解和推測果膠鈣凝膠分子的化學結構。

果膠是由D-半乳糖醛酸(GalA)以α-1，4 糖苷鍵連接而成的線性雜多糖，且其部分半乳糖醛酸含有甲氧基，據其甲氧基含量將果膠分為高甲氧基果膠和低甲氧基果膠［3］。

天然果膠存在于植物中，在不同的植物、植物的不同組織及不同生長階段，果膠的結構均不同，所以，果膠結構具有多樣性。此外，提取方法和提取過程也會使其結構發生變化［4］。由此可見，由果膠所形成的果膠鈣凝膠的結構自然也不均一。

果膠類多糖分子結構內有光滑區和毛發區:光滑區由α-D-半乳糖醛酸殘基以(1→4)-糖苷鍵連接;毛發區由高度分支的α-L-鼠李半乳糖醛酸組成。因此，根據結構不同，可將果膠分子結構區分為半乳糖醛酸聚糖(HGA)、鼠李半乳糖醛酸聚糖-I (RG-I)和鼠李半乳糖醛酸聚糖-II(RG-II)三類不同的結構區［3］。

HGA 是α-D -半乳糖醛酸殘基以(1→4)-糖苷鍵連接而成的線性糖鏈區，其羧基有不同程度的甲酯化［4-6］，該區域主要為果膠或果膠鈣的光滑區結構;若在HGA 中間插入鼠李糖(Rha)，即為RG-I 區，它是由半乳糖醛酸和鼠李糖交替組成的重復單元:4-α-D-GalA-(1→2)-α-L-Rha-1［4，6］;RG-II 與RG-I 的結構完全不同，其骨架常由9 個半乳糖醛酸經α-1，4 糖苷鍵連接而成，已確認該骨架常由固定且不同單糖組成4 種支鏈結構，進而構成果膠的毛發區域，已發現這些固定單糖殘基有11 種之多，包括一些稀有單糖類似物，如芹菜糖、槭汁酸、2-脫氧酮-3-D -甘露-辛酮糖酸，因而該種結構區域更為復雜［4-6］。

上述果膠分子結構表明，雖然果膠鈣凝膠是由果膠分子自由羧基與鈣離子靠靜電力結合而形成的，但其化學結構仍然由于果膠分子的多樣性而呈現諸多不同。除此之外，果膠與鈣離子的結合也會導致果膠鈣結構的差異。如果膠鈣凝膠膜的紅外光譜顯示:其甲酯基與自由羧基(1 740 cm-1)，以及離子化羧基(1 610 cm-1)的吸收峰向高波數移動，這些峰的吸收強度隨著與鈣離子結合濃度的升高而增加，這些說明鈣離子與果膠的結合改變了果膠官能團之間的相互作用［7］。介觀結構研究表明，果膠鈣凝膠呈現均勻的網絡狀結構，隨著果膠鈣凝膠形成的時間和鈣離子濃度的變化，網狀結構也會發生變化［8］。

3 形成果膠鈣凝膠的模型——“蛋箱(egg-box)”結構模型

早在1973 年Grant 等人就提出了“egg-box”蛋箱結構模型(圖1)，他們認為，2 條反平行雙螺旋果膠糖鏈共同連接鈣離子，構成“波狀”的蛋箱結構，兩條鏈通過靜電力緊密相連［9］;就像兩條鋸的鋸齒的齒尖相互結合一樣，而鋸齒齒距間即凹型部分構成了“蛋箱”式結構。蛋箱模型被廣泛接受，并且得到證實［10-11］。但是，只有當分子鏈上連續未酯化的GalA殘基達到6 ～13 時，才能形成蛋箱結構［12-13］。

4 形成果膠鈣凝膠的影響因素

果膠鈣凝膠的形成受內因和外因的影響。內因是指果膠分子結構的特征，如甲氧基的數量和分布、鏈長、側鏈、酰胺基、乙酰基、鈣離子和果膠濃度等。而外因則指形成果膠鈣凝膠的條件，如糖濃度、離子強度、pH 值和溫度等，這些因素之間是相互制約和相互影響的。例如，隨著鈣離子濃度的提高，凝膠性質的改變受酯化度、果膠濃度、pH 值的影響也越大。

圖1 果膠鈣凝膠蛋箱模型Fig.1 “Egg-box”model of calcium pectinate gels

4.1 影響形成果膠鈣凝膠的內因

4.1.1 果膠的酯化度(DM)和甲氧基區域分布程度(degree of blockiness，DB)

DM 值越低，即果膠鏈中未酯化GalA 越多，越有利于與鈣離子的結合，即越有利于形成果膠鈣凝膠［14-15］。

果膠鈣凝膠蛋箱結合區的形成能力還也取決于DB。果膠鏈上甲氧基有區域分布(圖2 -a 和圖2 -c)和隨機分布(圖2 -b)2 種類型。前者DB 值高于后者，有利于果膠鏈與鈣離子的連接形成蛋箱結構［15］。所以，DB 值越高，越有利于形成果膠鈣凝膠。

圖2 高甲氧基果膠(DM=50%)中的甲氧基分布示意圖Fig.2 Distribution of carbomethoxy in HM pectin(DM=50%)

一般地，利用半乳糖醛酸內切酶(PGE)專一性地降解果膠鏈，利用酶指紋技術來描述和測定DB 值。PGE 是內切酶，可以切斷未酯化GalA 之間的糖苷鍵，使果膠鏈中未酯化的GalA 以單糖、二聚糖和三聚糖的形式釋放出來(圖3)，進而根據圖3 所示計算DB。DB 等于被PGE 釋放的低聚物總數與未酯化GalA 總數之比。這個參數僅與未酯化GalA 數目有關，與GalA 總數目無關。但DB 不能反映DM 的變化，因此與果膠鈣凝膠特性相關性不大［15］。為了得到更準確的甲氧基的分布與凝膠特性的定量關系，Guillotin 等提出了絕對甲氧基區域分布程度(absolute degree of blockiness，DBabs)的概念［16］。DBabs等于被PGE 釋放的低聚物總數與GalA 殘基總數(酯化GalA和未酯化GalA 之和)之比。前人用不同方法(堿和酶)脫去果膠甲氧基，并以得到的果膠進行果膠鈣凝膠研究［6，17］。結果表明，DBabs與果膠鈣凝膠強度有很強的相關性。

圖3 半乳糖醛酸內切酶(PGE)水解果膠原理及DM、DB、DBabs的計算Fig.3 Simplified scheme of pectin digestion by PGE and calculation of DM，DB and DBabs

但是，根據DBabs僅能估計整個果膠樣品的酯化區域分布，它不能反映果膠樣品中每條分子鏈的酯化區域的分布。在果膠鏈上，有的酯化區域較短(圖2-a)，而有的則相反(圖2 -b)，前者形成的凝膠強度更大［18］。在一定酯化度下，當未酯化GalA 區域的GalA 數量等于形成穩定蛋箱結構所需的GalA 最小值時，形成的凝膠強度最大，因為這種分布可以使結合區域(蛋箱結構)最大化［19］。

4.1.2 分子質量

果膠鈣凝膠的強度和分子量呈正相關［20-21］，分子量太小的果膠不能形成果膠鈣凝膠。但在特定聚合度范圍內，適當添加過量鈣離子可以防止凝膠強度的下降，即增加離子交聯可以彌補共價鍵斷裂造成的凝膠強度降低［22］。研究發現，每條果膠鏈上至少有兩個結合區才能形成網絡，僅有一個結合區的短鏈不但不能形成交聯，還會占用長鏈的結合位點，阻礙果膠鈣凝膠形成［13，23-24］。

4.1.3 支鏈

果膠主鏈上的鼠李糖殘基使線性半乳糖醛酸鏈出現分支，少量D-木糖、L-阿拉伯糖和D-半乳糖等殘基存在于這些分支上。一定量的支鏈可以防止果膠鈣凝膠脫水，但是支鏈過多會增加果膠鏈的空間位阻，阻礙糖鏈的交聯［22］。Budolfsen 和Heldt-Hansen發現，果膠甲酯酶(PME)和脫支酶對凝膠強度和流變性質的改變有協同作用［25］。脫支酶可能會提高PME 活性，降低酯化度，并且/或直接地加強果膠鈣的交聯。但是Schmelte 等人的研究有不同的結論，他們分別用混合酶(PME、脫支酶)和PME 處理果膠，2種果膠形成的果膠鈣凝膠有相似的性質［26］。但是Schmelt 的研究沒有說服力，因為脫支酶僅釋放少量的中性糖，它對果膠的功能性質影響很小。這些差異還有待進一步研究。

4.1.4 酰胺基

酰胺基是果膠在脫甲氧基的過程中與氨基反應形成的，它可以改變果膠鈣凝膠的黏彈性［22，27］。由于酰胺基之間氫鍵的連接，酰胺化果膠具有更高的凝膠強度(尤其在低pH 值條件下)［28］。與一般果膠相比，由于氫鍵的增加和游離羧基的減少，酰胺化果膠形成果膠鈣凝膠需要的鈣離子要少［29］。

4.1.5 乙酰基

乙酰基使果膠與鈣離子的連接不牢固，乙酰化果膠(如甜菜果膠)難以形成果膠鈣凝膠［29］。Oosterveld 等用乙酰酯酶和PME 共同處理甜菜果膠后，果膠的凝膠強度明顯提高。乙酰酯酶除去乙酰基后，PME 的活性提高，大大降低了果膠的酯化度，果膠鈣凝膠更易形成［30］。但是，該研究不能說明酰胺基對蛋箱結構的形成有直接影響。

4.2 影響形成果膠鈣凝膠的外因

4.2.1 鈣離子濃度

在果膠鈣凝膠的研究中，鈣離子濃度常以R(R=2［Ca2+］/［COO-］)表示［31-32］，而不是以全部鈣離子濃度表示。R 體現了Ca2+濃度與果膠鏈上游羧基數量的聯系，進而間接地體現了與酯化度的聯系。

在果膠溶液中，隨著R 的升高，蛋箱結合區增加，凝膠強度提高。假設所有的鈣離子都存在于蛋箱結構中(圖1)，R=0.5，果膠鈣結構穩定。但是，再添加鈣離子，只是會增加一些微弱的靜電力，這些力對凝膠強度的貢獻非常小［21］。當R ＞1 時，鈣離子阻礙凝膠強度的提高［1，33］。

R 值過高，凝膠發生相分離或分層現象。相分離類型取決于果膠濃度。濃度低時，果膠沉淀(鹽析作用)。濃度高時，凝膠脫水［34-35］。凝膠沉淀和脫水影響食品的品質，所以在食品應用中，要避免發生相分離。

4.2.2 果膠濃度

R 值一定時，凝膠強度隨果膠濃度的提高而增加［1，33］。果膠濃度低時，分子內形成離子鍵的概率很大，但這種分子內鍵對凝膠網絡結構的形成卻沒有任何貢獻。隨著果膠濃度的提高，分子內鍵減少［32］，更多有效的交聯區域形成［35］。

4.2.3 pH 值

為了使果膠的羧基和鈣離子之間形成離子交聯，果膠必須帶電荷，羧基處于解離狀態。GalA 單體的pKa 約為3.5，果膠中GalA 的pKa 略有不同，它取決于DM 和DB［15］。pH ＞5 時，凝膠性質與pH 無關;而當果膠鈣凝膠的pH 降到4.5 以下，果膠的電荷密度下降，與鈣離子的親和力隨之降低。但是，這種影響也會因為質子化的羧基之間形成氫鍵而得到一定程度的補償［32，35］。pH ＜3.5 時，即使沒有鈣離子，低甲氧基果膠也會凝膠。隨著pH 值的降低，伴隨著羧基質子化，果膠由雙螺旋向三螺旋構象轉換。三螺旋果膠鏈之間通過氫鍵交聯［35］。在強酸性條件下，雖然果膠的電荷密度低，鈣離子仍會促進凝膠。此外，酰胺基也有助于低甲氧基果膠在酸性條件下凝膠，因為酰胺化果膠電荷密度比非酰胺化果膠低，同時酰胺基之間的氫鍵也可強化凝膠結構［29］。

4.2.4 糖濃度

研究表明，可溶性固形物(如糖類)的添加有利于果膠鈣凝膠的形成。凝膠強度的增加程度取決于糖的濃度、種類和pH。例如，蔗糖比葡萄糖更能提高凝膠強度，而果糖則比葡萄糖的作用更小［36］。目前，小分子糖類提高凝膠強度的機理還不是很清楚。有研究認為，糖可以降低水分活度，加強果膠-果膠相互作用，降低果膠-水的作用［28］。而部分多元醇(如山梨醇)會與果膠競爭鈣離子，對凝膠不利。

4.2.5 離子強度

低甲氧基果膠溶于水后，分子間存在電荷斥力，所以果膠鏈之間的交聯。但是，鈣、鈉、鉀等金屬離子可以掩蔽聚合物的電荷，減小分子間斥力，當分子間斥力減小到最低時，離子成為交聯劑，分子鏈間形成網絡。研究表明，有NaCl 存在時，果膠能在較低的鈣離子濃度時形成果膠鈣凝膠［37］。但是在僅有Na+、K+這樣的一價陽離子存在的情況下，也能形成凝膠，電荷中和和離子強度效應的共同作用促使凝膠形成［38］。

但是，檸檬酸、酒石酸、抗壞血酸等有機酸對凝膠的形成有不利影響。這些在食品工業中常見的有機酸會螯合二價離子，從而與果膠競爭鈣離子［55］，增加形成凝膠所需的鈣離子量［39］。

4.2.6 溫度的影響

為了得到均勻的果膠鈣凝膠，果膠和鈣離子需要在高溫下先混合再冷卻。降溫過程中，果膠-鈣混合物由溶膠向凝膠轉變，隨著溫度的緩慢下降，凝膠強度逐漸增加［36］。溶膠-凝膠轉化的溫度取決于果膠結構和凝膠組成［29］，高溫下形成短的結合區，在冷卻過程中，由于氫鍵形成，這些結合區更加穩定，與此同時鈣離子被固定在其中。

需要注意的是，果膠鈣凝膠受熱后能夠熔化，是熱可逆凝膠。但是凝膠熔化的溫度比形成凝膠時要高(熱滯后效應)［40］。然而，過高的溫度會導致果膠發生解聚，解聚的機理和速率取決于果膠的酯化度和pH［41］，果膠的解聚會對果膠鈣凝膠產生不利影響。

5 果膠鈣凝膠的應用

由于含水量高的果膠鈣凝膠和干性果膠鈣均不溶于水，因此，對于各種果膠鈣的應用，都是先將低甲氧基溶解后，再加入適量的氯化鈣等鈣離子溶液，在適當的條件下，形成果膠鈣或其凝膠等形式。具體地說，主要應用在食品、藥物、微生物、生產果膠等方面。

5.1 應用于食品

果膠鈣凝膠可以做食品添加劑涂布于焙烤和油炸食品(如面包、土豆、洋蔥圈、肉類等)的表面，防止食品在油炸過程中吸收油分，保持食品的水分，提高酥脆性和熱穩定性［2，42］。Gerrish 等認為，可以用鈣敏感型果膠溶液處理富含鈣離子的食品，或者將果膠溶液涂布于食品表面再用鈣鹽溶液浸泡，這2 種方式都可以使食品表面覆蓋果膠鈣凝膠［2］。酯化度低于40%的低甲氧基果膠對鈣離子敏感，是做食品果膠鈣凝膠涂層的首選。此外，果膠的分子質量對果膠鈣凝膠的攔油能力有很大影響，分子質量越大效果越好，若低甲氧基果膠的分子質量高于15 000 u，果膠鈣凝膠的攔油能力最大。

5.2 靶向藥物

果膠鈣凝膠具有很好的生物相容性和黏膜靶向性，被廣泛地用作藥物和生物活性物質的載體。以果膠鈣凝膠為載體的藥物制劑，經口服給藥后具有緩控釋放的作用。果膠鈣凝膠作為緩控制劑的新型輔料，克服了以往緩控制劑在體內受飲食、疾病等因素影響的缺陷［43］，尤其是作為結腸定向釋放藥物優點更突出，是目前研究較多的一個方向。果膠鈣凝膠在pH值較低的溶液中穩定，在堿性溶液中溶脹，而結腸恰好具有較高的pH 值和合適的果膠酶，因此果膠鈣凝膠就能保證制劑中藥物在結腸中的特異性釋放［44］。而單純的果膠則不完全具備這些特性，因此在藥物載體的應用中受到限制。果膠的分子質量、酯化度和鈣離子的濃度會影響果膠鈣凝膠性質，進而影響藥物釋放效果［45-47］，因此，要根據不同的藥物和藥物在體內的作用位置選用合適的果膠鈣。

5.3 固定化微生物

果膠鈣凝膠還常被用于固定微生物細胞。Toth等用藻酸鈣凝膠和果膠鈣凝膠分別包埋大腸桿菌，比較2 種凝膠對大腸桿菌代謝活性的影響。結果表明，2 者均能保持較長時間代謝過程，但是，果膠鈣凝膠傳遞代謝產物的速度更快［48］。Jozef Nah＇alka 等將重組大腸桿菌包埋在果膠鈣凝膠中，用來生產三磷酸核苷。在他的研究中，果膠鈣凝膠顆粒在培養液中浸泡60 d 仍保持穩定。前人對果膠鈣凝膠做了改良，使該凝膠使用時間更長［49］。Kurillova 等人在果膠鈣凝膠顆粒的表面覆蓋了一層聚乙烯亞胺和戊二醛混合物，結果表明，該工藝攔截了高濃度的酒石酸等掩蔽劑對果膠鈣凝膠的破壞，使果膠鈣凝膠能保留細胞長達360 多天［50］。果膠鈣凝膠的穩定性使其在固定微生物細胞方面得到廣泛應用。

5.4 生產果膠

果膠鈣凝膠還可以作為生產果膠的中間產物［51］。將果膠鈣凝膠與酸性乙醇溶液以一定比例混合，并結合攪拌或勻漿等處理方式使H+與Ca2+的置換，再經過過濾、干燥后得到果膠。Olsen 認為這種方法得到的果膠會含有少量的鈣離子，但是Ca2+的存在不影響果膠的凝膠性質［52］。與目前常用的乙醇沉淀法和鐵、鋁等鹽析沉淀法生產果膠相比，這種方法所生產果膠的成本和能耗均較低，且不存在有害金屬殘留的缺點。

6 今后的研究重點

盡管利用果膠鈣凝膠生產果膠是解決果膠生產成本高的一個途徑，但這種生產工藝推廣的難度比較大，主要是因為果膠原料的果膠含量、相關果膠的性質(分子質量、酯化度、DB、R 等)、生產工藝條件(粒度、處理pH、溫度、時間)等因素均影響果膠鈣凝膠的性質與產量，這些條件與果膠鈣凝膠脫鈣過程同樣有關。所有，有必要繼續加強果膠鈣凝膠的形成與脫鈣等方面化學熱力學與動力學等方面的研究，以掌握好利用果膠鈣凝膠生產果膠的生產工藝和操作參數的區間范圍。

由于DB、DBabs、R 值是影響果膠鈣凝膠形成的重要參數，但用PEG 測定這些指標時，會受到酶供應的制約，并且測定過程比較繁瑣。因此，毫無疑問，簡便、快速、準確地測定DB、DBabs值的方法是一個迫切需要解決的問題。

果膠鈣凝膠的應用研究，除進一步拓展其在藥品、食品、生物工程等領域中的應用外，應當進一步開展其生物活性(如降血脂［53］等)等理化性質的研究，以為擴大其應用提供必要理論依據。

7 結語

由于果膠鈣的制作工藝簡單且生產成本低，具有化學性質穩定、食用安全、生物相容性好等優點，相信其化學結構、理化性質、生物活性、分析測定等方面的系統研究，會有效地控制形成果膠鈣凝膠的質量，進而滿足不同加工產品的要求，進一步拓寬其在食品、藥品、生物工程等領域的應用。

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