豆渣發酵醬油關鍵技術*

張夢茹，劉美蓉，朱娜麗，全明明，張寶善

(陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西 西安，710119)

豆渣是大豆產品加工過程中的副產品，約占全豆的15% ～20%。其營養成分高于眾多槽渣，含有豐富的蛋白質、脂肪、膳食纖維、異黃酮、B 族維生素以及鈣、鐵、鋅、鉀等多種微量元素。研究表明，每100 g干豆渣中含有水分8.31 g，蛋白質19.32 g，脂肪12.40 g，纖維素51.8 g，灰分3.54 g［1-2］，是典型的低熱能高植物蛋白的食品資源，更是一種很重要的天然膳食纖維資源。但是豆渣的能量含量低、含水量較高、保質期短等特性使其再利用受到一定限制。在我國，傳統利用方式是將豆渣作為飼料，直接喂養動物;在日本，大量的豆渣被焚燒掉;在香港，豆渣通常作為廢棄物堆放。這樣不僅使其營養成分大量流失，同時也造成了環境污染。因此，如何更好地利用豆渣成為急需研究和解決的問題。

因此，本實驗以豆渣代替豆粕為原料，發酵生產我國傳統的發酵調味品醬油。傳統的醬油是采用低鹽固態發酵法以大豆為原料，經過熬制、發酵、淋取等工藝制成。其原料昂貴，且發酵曲種單一，導致蛋白質分解不足，利用率較低。近年來，多采用多菌種制曲發酵工藝，如利用米曲霉和黑曲霉混合制曲，彌補因單一菌種釀造醬油而使蛋白質分解不足的缺陷。原料處理方面，對原料進行酶解處理，采用纖維素酶［3］，破壞原料細胞壁，釋放出蛋白質和淀粉，利于發酵進行，同時還可以起到增加色度并提高還原糖的作用。本實驗在傳統低鹽固態發酵的基礎上，采用米曲霉與黑曲霉雙菌混合發酵生產醬油，可望擴充醬油的生產原料來源，并提高豆渣的利用率。

研究證實，原料配比、菌種配比、高壓蒸煮時間、鹽水濃度和冷熱殺菌對成品品質都有不同程度的影響。因此，本實驗主要對這5 個因素進行探究優化，通過單因素實驗和正交試驗，最終得到豆渣發酵生產醬油的最佳工藝參數，并且對 成品進行感官、理化和衛生指標的檢驗分析。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料

黃豆豆渣:自制豆渣;麥麩;豆粕;市售食鹽

發酵菌種:米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)，來自于陜西師范大學食品發酵實驗室。

1.1.2 設備

LX-B50L 不銹鋼蒸汽消毒器，上海民橋精密科學儀器有限公司;GHX-9080B-1 型隔水式恒溫培養箱，上海福瑪試驗設備有限公司;JY301 型電子天平，上海民橋精密科學儀器有限公司;GZX-914MBE型數顯鼓風干燥箱，上海民橋精密科學儀器有限公司;SW-CJ 型超凈工作臺，上海雷鈞試驗儀器制造有限公司;PHS-3C 型精密PH 計，上海精密科學儀器有限公司;Kjeltec 2300 全自動凱氏定氮儀，瑞典福斯公司;JTMX-LHS-100SC 恒溫恒濕培養箱，北京中西遠大科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 菌種的制備

將米曲霉(黑曲霉)接入斜面試管上，控制培養溫度為30℃，恒溫培養48 h 至長滿厚密的黃綠色孢子(褐黑色孢子);再將培養好的斜面菌種接入三角瓶中培養，搖勻，控制培養溫度為30℃，恒溫培養20 h，瓶內麩皮曲料發白結餅，搖瓶一次，搖碎結塊，再過4 h 再搖瓶1 次，繼續培養至48 h，整個麩皮曲料全部變為黃綠色(黑色)，三角瓶中已培養好。

1.2.2.2 制曲

將所需原料按實驗設計配比混合均勻，按照原料干基∶水(m∶m)=1∶2 潤水后于121℃下滅菌，冷卻至30℃左右，按實驗設計分別接種米曲霉和黑曲霉，30 ～32℃［4-5］分別制曲36h［6］。

1.2.2.3 混合發酵

將成曲混合均勻后按照干料∶食鹽水(m∶m)=1∶2.5 加入進行發酵，發酵結束后，浸出濾油，分別評價醬油的感官特性，測定全氮含量、氨基酸態氮、可溶性無鹽固形物含量。

1.3 豆渣發酵醬油工藝參數的確定

1.3.1 原料配比對發酵醬油品質的影響

選取豆渣和麩皮，將其按照不同比例分為4 組:

(1)豆渣∶麩皮=8 ∶2;(2)豆渣∶麩皮=7 ∶3;(3)豆渣∶麩皮=6∶4;(4)豆渣∶麩皮=5∶5

1.3.2 菌種配比對發酵醬油品質的影響

采用米曲霉與黑曲霉接種量4∶1 混合、米曲霉與黑曲霉接種量3∶1 混合、米曲霉與黑曲霉接種量1∶1、米曲霉與黑曲霉接種量1∶3 混合混合這4 種方式進行發酵。

1.3.3 高壓蒸煮時間對發酵醬油品質的影響

選取高壓蒸煮時間為20、30、40、50 min 進行研究。

1.3.4 鹽水濃度對發酵醬油品質的影響

選取鹽水濃度分別為6%、8%、10%、12%對其進行研究。

1.3.5 冷殺菌與熱殺菌對發酵醬油品質的影響

采用冷殺菌技術(超聲波殺菌、微波殺菌)對醬油滅菌，并與傳統熱殺菌技術比較，檢測成品醬油的穩定性，確定最佳殺菌方法和工藝參數。

1.3.6 豆渣發酵醬油工藝參數的優化

參考以上單因素實驗結果，采用L9(43)正交表進行正交試驗。

1.4 測定方法

1.4.1 發酵過程中醬油全氮含量變化的測定

從制曲開始到發酵結束整個過程中，隔天取樣。用全自動凱氏定氮儀對樣品中的全氮含量進行測定。

1.4.2 發酵過程中醬油氨基酸態氮含量變化的測定

從制曲開始到發酵結束整個過程中，隔天取樣。按照GB/T 5009139 -2003 中甲醛值法對樣品中的氨基酸態氮含量進行測定。

1.4.3 發酵過程中醬油可溶性無鹽固形物含量測定

醬油中總固形物含量減去NaCl 含量即為可溶性無鹽固形物含量。NaCl 含量的測定采用GB/T 5009139 -2003。

1.4.4 感官特性評定方法

根據《GB 18186 -2000 釀造醬油》，結合豆渣發酵醬油自身的特點，以色澤、香氣、滋味和體態這四項作為指標，每項25 分，總分100 分。具體評分標準如表1 所示。

表1 豆渣發酵醬油的感官特性評分標準Table 1 The sense evaluation standard of Fermenting soy sauce using bean dregs

1.4.5 理化特性評定方法

根據《GB 18186 -2000 釀造醬油》，結合豆渣發酵醬油自身的特點，以可溶性無鹽固形物、全氮含量、氨基酸態氮含量這3 項作為指標。具體標準見表2。

表2 豆渣發酵醬油的理化指標Table 2 The physical and chemical index of fermenting soy sauce using bean dregs

1.4.6 衛生指標評定方法

我國醬油的衛生標準經過了1996 年、1981 年、2003 年的多次修訂，目前按《GB 2717 -2003 醬油衛生標準》執行。具體的微生物指標見表3。

表3 豆渣發酵醬油的微生物指標Table 3 The microbiological indicator fermenting soy sauce using bean dregs

2 結果與分析

2.1 原料配比對豆渣發酵醬油品質的影響

原料配比是影響豆渣發酵醬油品質的一個重要因素。根據預實驗結果分析，選擇豆渣四個不同水平的添加量對制曲物料配比做進一步優化。豆渣發酵醬油的最佳接種量為干料量的0.1% ～0.3%，保持培養溫度28 ～30℃制曲，在成曲中按1∶2 加入食鹽水，45℃培養發酵。

表4 原料配比對豆渣發酵醬油品質的影響Table 4 The effect of ratio of raw materials on fermenting soy sauce using bean dregs

由表4 可知，當原料配比為m(豆渣)∶m(麩皮)=6∶4 時，醬油中全氮含量、氨基酸態氮含量、可溶性無鹽固形物含量及感官評定均優于其他組。原料配比按m(豆渣)∶m(麩皮)=7∶3 發酵制成的醬油理化指標均高于原料比為5∶5，但是感官評定略低于原料比為5∶5。因此，當原料配比在7∶3 與6∶4 之間時，豆渣發酵醬油的品質最佳。

2.2 菌種配比對發酵醬油品質的影響

米曲霉產生中性蛋白酶的能力比較強［7-8］，生成酸性蛋白酶的能力較弱，而醬油的發酵過程一般都處于偏酸條件下，這就對蛋白質的分解利用造成一定困難，而黑曲霉不但能產生較多的酸性蛋白酶，而且能產生米曲霉不能產生的纖維素酶、柚甘酶等多種酶。所以利用米曲霉和黑曲霉混合制曲，能夠彌補單一米曲霉釀造醬油酸性蛋白酶活力太弱的不足，使醬醅中各種酶的比例更趨合理，從而提高氨基酸的生成率，原料的全氮利用率和出品率［9］。所以本實驗采用混合菌種制曲。在雙菌制曲中，適宜的菌種配比對醬油的品質有很大的影響。在上述2.1 的恒定條件下，豆渣與麩皮質量比6∶4 混合，根據預實驗的結果，選取米曲霉和黑曲霉比例分別為4∶1 ，3∶1 ，1∶1 ，1∶3對其進行優化研究。

由表5 顯示，隨著米曲霉所占比例的增大，全氮含量、氨基酸態氮含量、可溶性固形物含量、感官評分均增大。當米曲霉與黑曲霉按4∶1 混合時，醬油的氨基酸態氮和可溶性固形物含量最高，當米曲霉與黑曲霉按3∶1 混合時，醬油中的全氮含量最高。當米曲霉和黑曲霉質量比為1∶3 時，雖然提高了氨基酸生成率，但會影響全氮的利用率，并且4 項指標均低于其他組。所以黑曲霉的用量不能過多，要以米曲霉為主要發酵菌種。故豆渣發酵醬油的最佳菌種配比介于3∶1 和4∶1 之間。

表5 菌種配比對醬油品質的影響Table 5 The effect of proportion of different bacteria on fermenting soy sauce using bean dregs

2.3 高壓蒸煮時間對發酵醬油品質的影響

按原料m(原料干基)∶m(水)=1∶2.5 潤水，在高壓蒸汽滅菌鍋內進行高溫蒸煮(固定蒸煮溫度為121℃，蒸煮時間設定4 個考察點:20 、30 、40 、50 min)、接種、發酵。實驗結果如表6 所示。

表6 高壓蒸煮時間對發酵醬油品質的影響Table 6 The effect of high pressure cooking time on fermenting soy sauce using bean dregs

蒸煮的主要目的是使原料中蛋白質分子發生適度變性，露出蛋白質分子內部的氨基酸支鏈，使其容易進行酶水解，同時達到殺菌的目的。如果蒸煮時間、溫度不足，蛋白質分子未達到一次變性，會產生曲霉蛋白酶不能分解的N 性物質。在高溫、長時間蒸煮后，一方面，蛋白質分子會發生過度變性，不能為曲霉蛋白酶所分解;另一方面，蛋白質分子會與糖分子發生褐變反應，從而降低氮的利用率，損失一部分氨基酸［10］。

由表6 可知，當蒸煮時間小于30 min 時，理化指標和感官評定隨著時間延長而呈上升趨勢，但當高壓蒸煮時間大于30 min 時理化指標和感官評定隨著時間延長而呈下降趨勢。因此，豆渣發酵醬油原料的最佳蒸煮時間為30 min 左右。

2.4 鹽水濃度對發酵醬油品質的影響

在豆渣發酵醬油過程中，向成曲中拌入鹽水的主要作用是防止發酵過程醬醅被雜菌污染，但過高的鹽水濃度會抑制蛋白酶的作用，使得發酵時間延長［11-12］。根據預實驗的結果，選取濃度分別為6%、8%、10%、12%、14%的鹽水對醬醅進行發酵。對發酵過程中樣品的理化指標和感官評定測定如表7 所示。

表7 鹽水濃度對發酵醬油品質的影響Table 7 The effect of brine concentration on fermenting soy sauce using bean dregs

實驗過程中發現，當鹽水濃度低于8%時仍有雜菌生長，導致醬油色澤暗淡，醬香味不濃，略有異味。但當鹽水濃度高于12%時，又會抑制酶的活性，延長發酵時間，降低原料中氮的利用率，同時由于抑制產香有益菌的生長，導致其香味很淡，從而影響醬油的質量。由表2 ～表4 可知，鹽水濃度為12%時醬油中全氮含量最高，在該鹽水濃度下成曲中蛋白質分解最好，氨基酸態氮形成也最高，但可溶性無鹽固形物含量稍低。故豆渣發酵醬油的最佳鹽水濃度為12%左右。

2.5 冷殺菌與熱殺菌對發酵醬油品質的影響

醬油生產中傳統的殺菌和抑菌技術主要是采用熱殺菌和添加防腐劑的方法［13］。但是這2 種殺菌方法也有很多不足的地方，熱殺菌容易導致醬油中熱敏營養成分的破壞，例如氨基酸和一些香氣成分，使醬油顏色褐變嚴重，不容易控制醬油的色澤，也會使有害副產物增多，以及具有能耗大等缺點。添加防腐劑容易給醬油帶來食品安全危害。而冷殺菌技術是具有能殺死微生物，對食品營養、質構、色澤和風味影響較小的殺菌技術［14］。

設置4 組實驗，采用冷殺菌技術(超聲波殺菌、微波殺菌)對醬油滅菌，并與傳統熱殺菌技術比較，檢測成品醬油的穩定性，確定最佳殺菌方法和工藝參數。1 號不做任何處理，作為空白對照;2 號組為超聲波殺菌，頻率為20 kHz，滅菌時間為20 min，當殺菌時間累計達到4 min 時，所滅菌的醬油微生物菌落總數達到了合格指標;3 號組為微波殺菌，在37℃實驗溫度下，微波輸出功率為720 W，樣品厚度20 cm，微波處理時間4 min，所滅菌的醬油微生物菌落總數達到了合格指標;4 號組為超高溫瞬時滅菌，135℃殺菌5 s，所滅菌的醬油微生物菌落總數達到了合格指標。

原料配比為豆渣∶麩皮=6∶4，菌種配比米曲霉∶黑曲霉=4∶1，發酵溫度為45℃，鹽水濃度為12%，蒸煮時間為30 min。發酵結果如下表:

表8 殺菌方法對發酵醬油品質的影響Table 8 The effect of sterilization methods on fermenting soy sauce using bean dregs

從表8 可看出，超聲波殺菌和微波殺菌與超高溫瞬時滅菌相比，對醬油的香氣成分的破壞較小、氨基酸損失較少，護色效果好。但高溫殺菌滅菌徹底，保鮮期長，彌補冷殺菌方法滅菌不徹底，保鮮期不長的缺點。因此采用冷殺菌與熱殺菌相結合的滅菌方法對醬油進行滅菌處理。

2.6 豆渣發酵醬油工藝參數的優化

為了確定豆渣發酵醬油最佳生產工藝參數，在以上單因素實驗的基礎上，以原料配比、菌種配比、高壓蒸煮時間和鹽水濃度為試驗因素，感官評定為指標，采用L9(43)正交表(表9)進行正交試驗。試驗結果分析見表9。

表9 豆渣發酵醬油正交試驗因素水平表Table 9 The factors and levels of fermenting soy sauce using bean dregs

表10 豆渣發酵醬油工藝參數確定實驗結果分析Table 10 The result of fermenting soy sauce using bean dregs’technology parameter and analysis of rang

3 結論

(1)麩皮添加量的多少影響醬油的色澤和鮮味，當豆渣與麩皮質量比為6∶4 時，成品醬油氨基酸態氮含量高，醬油有光澤，醬香味濃郁。

(2)利用米曲霉和黑曲霉混合制曲，能夠彌補單一米曲霉釀造醬油酸性蛋白酶活力太弱的不足，當米曲霉與黑曲霉接種比例為4∶1 時，蛋白酶活力強，原料全氮利用率高，氨基酸生成率高。

(3)當蒸煮時間為30 min 時，原料中蛋白質分子發生適度變性，露出蛋白質分子內部的氨基酸支鏈，使蛋白質容易進行酶水解，同時達到殺菌的目的。醬油品質較高。

(4)鹽水濃度為12%時醬油中全氮含量最高，在該鹽水濃度下成曲中蛋白酶活力強，蛋白質分解最好，氨基酸態氮形成也最高。

(5)冷殺菌與熱殺菌相比，對醬油的香氣成分破壞較小、氨基酸損失少，護色效果好。但高溫滅菌徹底，保鮮期長，彌補冷殺菌方法滅菌不徹底，保鮮期不長的缺點，因此建議將冷殺菌作為醬油的輔助消毒或協同滅菌，冷熱殺菌相結合的滅菌方法對將有進行滅菌。

(6)通過正交試驗對發酵豆渣醬油的工藝參數進行優化，確定豆渣醬油的最佳工藝參數。結果表明，制曲原料配比為豆渣∶麩皮=6∶4，原料干基∶水(m∶m)= 1∶2.5 潤水;最佳發酵條件為米曲霉∶黑曲霉(m∶m)=4∶1，發酵溫度45℃，鹽水濃度12%，發酵時間為15 d。成品達到了《GB18186 -2000 釀造醬油》低鹽固態發酵法二級醬油的標準。

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