反復凍融和超聲協同作用破碎酵母細胞*

苑華寧，黃冬云，張暉，錢海峰，王立，齊希光

(江南大學食品學院，江蘇 無錫，214122)

近年中國啤酒工業迅速發展，成為啤酒產量最大的國家，2012 年啤酒產量達到4 900 萬kL，占全球產量的1 /4 。該行業的迅猛發展帶來了大量的廢棄酵母，啤酒酵母中含有大量的營養物質，50%左右的蛋白質，23% ～28%碳水化合物，6% ～8%核糖，2% B族維生素，1% 谷胱甘肽以及豐富的氨基酸、礦物質［1］，對酵母進行破碎，是綜合利用酵母的一種有效途徑。酵母細胞壁較厚，難以破碎［2-3］，目前破碎酵母細胞的方法主要有酶法破壁、化學法破壁、物理法破壁。酶法酶制劑較貴，酶解時間長;化學法對蛋白質的損傷較大，容易引起蛋白質變性;單一的物理方法(如微珠法、反復凍融法、高壓勻漿法、超聲波法)破壁效率低、能耗大［4-5］。

反復凍融法是較溫和的破壁方法，可以避免高溫對原料造成的營養損失、風味裂變等不良影響［6］。超聲波破碎是一種有效的、溫和的破碎細胞的方法，由于超聲引起空穴，液體會形成小氣泡，在氣泡發生空穴的破碎期間，大量聲能轉化成機械能，引起剪切梯度使細胞發生破裂［4］，目前已廣泛應用于微生物和植物細胞中核酸、蛋白質的提取［7-8］。啤酒酵母細胞壁厚難以破碎，要有效利用細胞中的營養成分必須對其進行破壁處理［9］，本研究以破壁率為指標，首次采用反復凍融法與超聲破碎法協同破碎酵母細胞，旨在提高酵母的破壁率，為進一步綜合利用酵母細胞提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

啤酒酵母，實驗室保藏;葡萄糖，國藥集團化學試劑有限公司;酵母膏，國藥集團化學試劑有限公司;蛋白胨，國藥集團化學試劑有限公司。

冷凍離心機，CR21GⅡ;超凈工作臺，蘇凈安泰二級生物安全柜BHC-1000ⅡA2;生物光學顯微鏡，Galen Ⅲ;超聲細胞粉碎儀，南京新辰生物科技有限公司;激光粒度分析儀，美國Microtrac 公司S3500 ;恒溫恒濕培養箱，SPX-150C 型;電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司AL104 ;pH 計DELTA320，上海分析儀器三廠;血球計數板，XB-K-25 血細胞計數板;高壓蒸汽滅菌鍋，YXQ-LS-SⅡ。

1.2 方法

1.2.1 酵母細胞培養

將酵母菌活化，接種于YPD 液體培養基中，在30℃、130 r/min 的培養箱中進行擴大培養20h，冷凍離心，滅菌去離子水洗滌3 次，離心取沉淀備用。

1.2.2 反復凍融法破壁參數的選擇

以酵母細胞的破壁率為指標，考察加水量和凍融次數對破壁效果的影響。

1.2.2.1 加水量的影響

設計7 個處理，分別噴加5%，10%，15%，20%，25%，30%，35%的無菌去離子水，慢速冷凍2 h，解凍1 h，如此反復凍融3 次。每個處理重復3 次。

1.2.2.2 凍融次數的影響

處理為噴加25%的無菌去離子水，分別凍融1、2、3、4、5、6 次，凍結2 h，解凍1 h，每個處理重復3 次。

1.2.2 超聲波法破壁參數的選擇

設定超聲輻射時間間隔為15 s，于冰浴中對酵母細胞進行超聲破碎。以破壁率為指標，考察超聲功率、超聲總時間、每次輻射時間、酵母濃度等因素對破壁效果的影響。

先進行單因素實驗，找出這4 個因素的影響規律和優化范圍。由于當功率達到500、600 W 時，超聲產生的熱效應很明顯，有部分細胞發生炭化沉于底部，所以單因素試驗的超聲功率取400 W、超聲總時間取15 min、每次輻射時間取10 s、酵母濃度取20 mg/mL。

為了得到酵母細胞破壁率與4 因素之間的量化關系，在單因素試驗基礎上，以酵母細胞破壁率為考察指標，以L9(34)正交表進行4 因素3 水平的正交試驗。正交設計見表1。

表1 L9(34)正交因素水平表Tab.1 L9(34)level of orthogonal factors

1.2.3 反復凍融及超聲波協同作用對酵母細胞破壁率的影響

將反復凍融與超聲波破碎技術相結合，比較單獨作用與協同作用條件下酵母細胞的破壁率。協同作用條件:加水量25%，慢速冷凍2 h、解凍1 h，反復凍融4 次，超聲功率400 W，每次輻射時間11 s，超聲總時間14.5 min，酵母濃度20 mg/mL。

1.2.4 破壁率的計算

采用活菌顯微鏡直接計數法，參照郭衛蕓［6］等人處理方法進行活菌計數。

其中，α 為酵母細胞的破壁率;M 為破壁前的酵母菌細胞數;N 為破壁后的酵母菌細胞數。

1.2.5 酵母細胞形態的觀察

采用日立S-4800 掃描電子顯微鏡(SEM)進行觀察。測試樣品參照孫鎮平［10］等人的高倍掃描預處理改進方法進行處理。

1.2.6 酵母粒度檢測

利用激光粒度分析儀對破碎前后的酵母溶液進行粒度分布測試。

1.2.7 數據分析

數據統計采用SPSS17.0 進行單因素方差分析及LSD 多重檢驗(P ＜0.05)，數值以均值± 標準差表示。

2 結果與分析

2.1 反復凍融法對酵母細胞破壁率的影響

2.1.1 加水量的影響

由圖1 可以看出酵母細胞的破壁率隨著加水量的增大呈現先增大后平緩的趨勢。在加水量為25%時破壁率達到了29.25%，加水量大于25%時，破壁率變化很小，可見加水量為25%時酵母細胞間隙幾乎被水分填充滿，使得反復凍融對酵母細胞的機械破壞作用幾乎達到最大。這與郭衛蕓［6］等人有關文獻報道相比稍有提高，可能與酵母菌種、凍融解凍速度條件有關。

圖1 加水量對酵母細胞破壁效果的影響Fig.1 Effect of water on the broken ratio of brewer yeast cell walls

2.1.2 凍融次數的影響

由圖2 可以看出，酵母細胞的破壁率隨著凍融次數的增加而增加。凍融次數低于2 次時，破壁率較小，增加不是很明顯，這可能是由于破壁率小不易觀察。當反復凍融超過3 次時，破壁率超過了30%，這可能由于冰晶的反復作用使得細胞破裂容易觀察。當凍融4 次以后，破壁率增加趨于平緩。

圖2 凍融次數對酵母細胞破壁效果的影響Fig.2 Effect of freezing and thawing times on the broken ratio of brewer yeast cell walls

2.2 超聲場對酵母細胞破壁率的影響

2.2.1 超聲功率的影響

超聲功率和頻率是影響超聲場強度的主要因素，當頻率不變，功率較低時超聲依靠機械效應和穩態空化效應使傳質邊界層減薄，一定程度上使粒子運動加速［11］，超聲功率增加時超聲在液體中的作用主要是通過激烈而短暫的瞬態空化效應完成的，高強度超聲產生的空化效應比低強度超聲時強得多，因此，功率越大超聲破碎程度越大［4］。由圖3 可以看出，隨著超聲功率的增大，酵母細胞的破壁率先增加后趨于平緩。當功率達到500、600W 時，超聲產生的熱效應很明顯，有部分細胞發生炭化沉于底部，因此選用的超聲功率為400W。

圖3 超聲功率對酵母細胞破壁效果的影響Fig.3 Effect of power on the broken ratio of brewer yeast cell walls

2.2.2 超聲總時間的影響

由圖4 可以看出，隨著超聲總時間的延長，酵母細胞的破壁率逐漸增加。這主要是由于能量具有累積效應，隨著超聲時間的延長，超聲穩流振蕩及空化效應積累越多，有利于酵母細胞的破碎。然而，能量的不斷積累［12］，可引起超聲波的化學效應，即能量能將溶出的大分子打斷或使其變性，所以并非時間越長越好。綜合考慮，選取超聲的總時間為15 min。

圖4 超聲總時間對酵母細胞破壁效果的影響Fig.4 Effect of total time on the broken ratio of brewer yeast cell walls

2.2.3 每次輻射時間的影響

由圖5 可看出，酵母細胞的破壁率隨著每次超聲輻射時間的增加呈現先增加后基本不變的趨勢，當每次輻射時間達到10 s 時，破壁率達到最大，此后基本不變。超聲波的空化效應需要一定的時間來完成［11］，每次輻射時間較短，超聲空化時的機械效應較低，細胞壁破壞較少;當輻射時間達到10 s 時，空化效應產生的機械作用使得酵母細胞細胞壁破裂。

圖5 每次輻射時間對破壁效果的影響Fig.5 Effect of ultrasound duration of irradiation each time on the broken ratio of brewer yeast cell walls

2.2.4 酵母濃度的影響

由圖6 可以看出，隨著菌體濃度的增加酵母細胞的破壁率呈現先增大后減小的趨勢。在濃度為20 mg/mL 時破壁率達到61.45%，此后隨著菌體濃度的增大，破壁率逐漸減小。由此可以推測，合理的酵母細胞濃度可以有效提高超聲破壁的效率，選取菌體濃度為20 mg/mL。

圖6 菌體濃度對酵母細胞破壁效果的影響Fig.6 Effect of yeast concentration on the broken ratio of brewer yeast cell walls

2.2.5 正交試驗結果

正交試驗結果如表2 所示，以表3 的方差分析為依據，選取超聲總時間作為誤差估計項，研究結果表明，B(超聲功率)和D(酵母菌濃度)對酵母細胞的破壁效果有顯著影響(P ＜0.05)。由極差分析可以看出影響酵母菌破壁效果的各種因素的主次關系為B(功率)＞D(菌體濃度)＞A(每次輻射時間)＞C(超聲總時間)。正交試驗結果結合K 值可知最佳破壁條件為B2D2A3C1，即超聲功率400W，每次輻射時間11 s，超聲總時間14.5 min，酵母濃度20 mg/mL。

表2 正交實驗結果Table 2 Orthogonal experimental results

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

2.3 反復凍融及超聲波協同作用對酵母細胞破壁率的影響

由表4 可看出，利用反復凍融與超聲破碎協同作用可使酵母細胞的破壁率達到89.31%，是反復凍融4 次單獨作用的2.4 倍，是超聲破碎單獨作用的1.5倍。劉曉永［13］等人的研究表明，研磨法的破壁率只有10.03%，超聲波法對釀酒酵母的破壁率只有76.36%，不能滿足研究的需要，珠磨機法的破壁效果良好，但設備需進口，較為昂貴。孫海翔［14］等人的研究表明，高壓均質法和高速分散法的破壁率在50% ～70%。反復凍融與超聲波協同作用破碎酵母細胞操作簡單、破壁率高，綜合比較發現協同作用是破碎酵母細胞的一種高效的方法。

2.4 酵母細胞形態結構的觀察

采用掃描電子顯微鏡(SEM)對破壁前后的酵母菌形態進行觀察，放大倍數為5.00K 時的圖像如圖7所示。從圖7 可以看出，破壁前酵母菌的形態比較完好，呈現顆粒狀的形態，經過破壁處理后大部分酵母菌細胞破裂，形態結構被破壞，呈現碎片的形態。

表4 3 種不同處理方法對酵母細胞破壁率的影響Table 4 Effect of three different treatment methods on the broken ratio of brewer yeast cell walls

圖7 破壁前后酵母菌的形態Fig.7 The morphology of yeast cells

2.5 酵母細胞粒度分布

由圖8 可以看出3 種方法處理前后酵母溶液的粒度分布的變化情況。破壁前酵母溶液的粒度分布如圖a 所示，該啤酒酵母的粒度分布比較窄，其中d0.1= 4.3 μm，d0.5=5.59 μm，d0.9=9.45 μm。反復凍融處理后酵母溶液的粒度分布如圖b 所示，經凍融后酵母溶液中約1/3 的酵母破碎，小顆粒的溶度有所增加，溶液顆粒分布變寬，其中d0.1= 0.076 μm，d0.5=2.713 μm，d0.9=4.47 μm。超聲破碎后酵母溶液粒度分布如圖c 所示，與b 圖相比小顆粒的濃度更大，說明破壁率比反復凍融的高，約3/5 的酵母破碎，破碎后的顆粒更小，其中d0.1= 0.049 μm，d0.5=2.144 μm，d0.9=4.21 μm。反復凍融和超聲破碎協同處理后酵母溶液的粒度分布如圖d 所示，超過4/5的酵母細胞被破碎，與其他2 種處理方法相比，破壁后溶液中的小顆粒分布更寬，其中d0.1=0.013 10 μm，d0.5=0.025 00 μm，d0.9=3.67 μm，說明絕大多數的酵母破壁成為碎片，協同處理破碎酵母的效率更高。

圖8 酵母溶液的粒度分布Fig.8 The particle size distribution of yeast solution

3 結論

反復凍融和超聲破碎協同作用是破碎啤酒酵母細胞的一種高效、溫和的處理的方法，該法能夠保持大分子物質的活性，為進一步綜合利用啤酒廢酵母提供了參考。通過試驗可以發現，反復凍融處理時，在加水量為25%、凍融4 次時破壁率達到37.75%;超聲破碎時，在超聲功率400W，每次輻射時間11 s，超聲總時間14.5 min，酵母濃度20 mg/ml 時破壁率達到61.45%;反復凍融和超聲協同處理后，酵母溶液的破壁率達到了89.31%，是反復凍融4 次單獨作用的2.4 倍，是超聲破碎單獨作用的1.5 倍。因此反復凍融和超聲波協同作用，是破碎啤酒酵母細胞壁的一種高效方法。

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