麻鴨脂肪氧合酶的分離純化及其性質(zhì)研究*

陳欣，姚忠，徐為民，孫蕓，王道營(yíng)

1(南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京，210014)2(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京，210014)

脂肪氧合酶(Lipoxygenase，LOXs)，又稱脂肪氧化酶，氧化還原酶屬，是一類非血紅素含鐵蛋白，能夠?qū)Ｒ坏卮呋哂衏is，cis-1，4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸的雙加氧反應(yīng)，形成具有共軛雙鍵的多元不飽和脂肪酸的氫過(guò)氧化物［1-3］。

LOXs 家族成員眾多，廣泛存在于動(dòng)物、植物、真菌、細(xì)菌、原生生物，甚至古細(xì)菌和病毒中［4-5］，根據(jù)加氧位置的不同可分為多種同工酶［6］，目前已知的LOXs 蛋白序列超過(guò)50 個(gè)，殘基數(shù)在661(兔紅細(xì)胞15-脂氧合酶)～923(水稻脂氧合酶-2)之間，其中植物來(lái)源的脂氧合酶較動(dòng)物來(lái)源的平均多150 ～200個(gè)殘基。

1932 年Andre 和Hou 首次發(fā)現(xiàn)大豆制品的豆腥味來(lái)源于多元不飽和脂肪酸的酶促氧化，而這一過(guò)程的關(guān)鍵酶就是LOX［7］。自此，有關(guān)LOXs 對(duì)于食品貯藏、加工中脂質(zhì)氧化的影響逐漸引起人們的關(guān)注。

1988 年Grossman 等研究證實(shí)了雞肉中存在LOX，且在-20 ℃保存12 個(gè)月酶活基本沒(méi)有損失，并證實(shí)了低溫凍藏的雞肉中的脂肪氧化是與LOX 的作用有關(guān)的［8］。Gata 等人采用離子交換和疏水層析等方法從伊比利亞豬股二頭肌中分離得到了LOX，并通過(guò)對(duì)其性質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)LOX 可能與伊比利亞火腿的風(fēng)味形成有關(guān)［9］。Bruce 等人從淡水鮭魚(yú)腮中提取得到LOX，通過(guò)凝膠過(guò)濾的純化方法確定其分子量為70 kDa［10］。Jin 等研究了五花肉中的LOX，發(fā)現(xiàn)溫度、NaCl 濃度、pH 對(duì)于其活性有很大的影響，在火腿生產(chǎn)過(guò)程中可以通過(guò)這些參數(shù)的改變來(lái)調(diào)控LOX 的活力及脂肪氧化情況［11］。姜穎等對(duì)去勢(shì)公兔和正常公兔中的腥味成分進(jìn)行了提取、分析，確定了引起腥味的物質(zhì)成分，并發(fā)現(xiàn)兔肉中的LOX 同工酶I可能與腥味產(chǎn)生有關(guān)［12］。

本文以麻鴨(shelduck)腿肉為原料，對(duì)其中的LOX(麻鴨LOX)進(jìn)行分離純化，并在此基礎(chǔ)上研究其催化特性和穩(wěn)定性，以期為鴨肉貯藏、加工過(guò)程中脂肪氧化及風(fēng)味形成機(jī)制研究，以及加工工藝的優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)原料

隨機(jī)選取70d 左右日齡健康麻鴨(2.5 kg 左右)，按企業(yè)的工藝要求宰殺后迅速取出股二頭肌，4℃下冷藏備用。

1.2.2 試劑及儀器

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、PMSF(苯甲基磺酰氟化物)、EDTA、β-巰基乙醇、硫酸銨、檸檬酸、檸檬酸三鈉、硼酸、四硼酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸均為分析純，吐溫20 為化學(xué)純，亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)sigma 公司，大豆脂肪氧合酶購(gòu)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社(TCI，Japan)，58 000 U/mg。

T25 高速勻漿機(jī)，德國(guó)IKA 公司;UniCenMR 高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Herolab 公司;Ultrospec7000 紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，美國(guó)GE Healthcare;DK-8D 恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠;考馬斯亮藍(lán)試劑盒，上海捷瑞生物;?KTA FPLC 層析儀、Hoefer SE 260 電泳儀，美國(guó)GE Healthcare。

1.2 麻鴨LOX 的分離純化

1.2.1 麻鴨LOX 的提取

參照Gata 等的方法對(duì)麻鴨LOX 進(jìn)行提?。?］。取鴨股二頭肌，剔除可見(jiàn)的結(jié)締組織及脂肪組織后均勻剁碎。加入3 倍體積的磷酸緩沖液(50 mmol/L，pH7.0，含0.5 mmol/L PMSF，1 mmol/L β-巰基乙醇，2 mmol/L EDTA)，在冰水浴中勻漿，冰水浴中攪拌90 min，然后于4℃下10 000 g 離心20 min;取上清液，以4 層紗布過(guò)濾，得到粗酶液。

1.2.2 麻鴨LOX 的純化

(1)硫酸銨沉淀:粗酶液以0 ～60% 和60% ～80%硫酸銨分級(jí)沉淀，將60% ～80%硫酸銨沉淀以少量磷酸鹽緩沖(50 mmol/L，pH 7.0)重懸混勻后，以50 mmol/L pH 7.0 的磷酸鹽緩沖液透析過(guò)夜。

(2)純化:以pH 9.0 的Tris-HCl 緩沖(50 mmol/L)平衡DEAE sepharose FF 層析柱(1.6 cm × 15 cm)，取2 mL 透析后的麻鴨LOX 樣品液進(jìn)樣，待基線平穩(wěn)后以洗脫緩沖(Tris-HCl，50 mmol/L，pH 9.0，含1 mol/L NaCl)梯度洗脫，收集洗脫峰，測(cè)定酶活;將麻鴨LOX 活性峰以凝膠色譜(HiLoad 26/60 Superdex 75)純化-脫鹽，收集洗脫峰，測(cè)定酶活;將所得活性峰以SOURCE 15Q 進(jìn)一步純化，平衡緩沖為T(mén)ris-HCl(50 mmol/L，pH 9.0)，以洗脫緩沖(Tris-HCl，50 mmol/L，pH 9.0，含1 mol/L NaCl)梯度洗脫，收集洗脫峰，測(cè)定酶活。

1.3 麻鴨LOX 酶活力測(cè)定

(1)底物溶液配制:0.5 mmol 亞油酸溶于5 mL含180 μL Tween 20 的脫氧重蒸水中，充分混勻;滴加1 mol/L NaOH 充分混勻使體系成為清澈透明的液體，再用1 mol/L HCl 調(diào)pH 至9.0，最后用脫氧重蒸水定容至50 mL。將配制好的亞油酸儲(chǔ)備液分裝保存在EP 管中，并于-20℃下儲(chǔ)存［13］。

(2)酶活測(cè)定:麻鴨LOX 酶活測(cè)定參照Kermasha 等的方法［14］。取0.2 mL 亞油酸儲(chǔ)備液與2.9 mL、50 mmol/L 的檸檬酸緩沖液(pH 5.5)充分混合，待其在234 nm 處的吸光值穩(wěn)定后，加入0.1 mL 酶提取液，迅速混合，于234 nm 處測(cè)定其1.0 min 內(nèi)吸光度值的增加量。以0.2 mL 亞油酸底物與2.9 mL 檸檬酸緩沖液混合為空白。

酶活定義:在一定的溫度和pH 條件下，1.0 min內(nèi)OD234增加0.001 為1 個(gè)酶活力單位(U)。

1.4 蛋白含量測(cè)定

以考馬斯亮藍(lán)試劑盒定量測(cè)定蛋白含量，每組3個(gè)平行樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 麻鴨LOX 的分離純化

按照1.2.2(2)的方法對(duì)60% ～80%硫酸銨沉淀粗提物進(jìn)行純化，結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可知，經(jīng)DEAE sepharose FF 純化后可得到2 個(gè)穿透峰和1 個(gè)洗脫峰(3 號(hào)峰)，其中3 號(hào)峰具有LOX 活力。

圖1 麻鴨LOX 的DEAE Sepharose FF 層析圖Fig.1 Chromatogram for purification of shelduck LOX with DEAE sepharose FF

將3 號(hào)峰超濾濃縮后，以凝膠色譜進(jìn)行進(jìn)一步的純化(色譜柱為HiLoad 26/60 Superdex 75)，色譜圖見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，凝膠色譜分離可得到2 個(gè)主要的色譜峰，其中1 號(hào)峰的LOX 活力最高，表明麻鴨LOX的分子質(zhì)量較大。

圖2 麻鴨LOX 的Superdex 75 凝膠層析圖Fig.2 Chromatogram for purification of shelduck LOX with Superdex 75

將凝膠色譜分離所得的活性峰(1 號(hào)峰)超濾濃縮后，以SOURCE 15Q 進(jìn)一步純化，結(jié)果見(jiàn)圖3。通過(guò)優(yōu)化洗脫梯度可得到多個(gè)洗脫峰，5 號(hào)峰的LOX活力最高。采用SDS-PAGE 對(duì)不同純化階段的樣品進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4 和圖5 所示。為了真實(shí)反映最終純化得到的樣品純度，圖5 采用了靈敏度更高的銀染色方法［15］。

圖3 麻鴨LOX 的Source15Q 柱層析圖Fig.3 Chromatogram for purification of shelduck LOX with SOURCE 15Q

圖4 不同純化階段樣品的電泳圖(考染)Fig.4 SDS-PAGE analysis for samples after different purification steps

圖5 SOURCE 15Q 純化后的樣品電泳圖(銀染)Fig.5 SDS-PAGE analysis for shelduck LOX after SOURCE 15 Q (silver staining)

經(jīng)硫酸銨沉淀、DEAE sepharose FF、superdex 75和SOURCE 15Q 多步純化后，最終得到樣品液中的麻鴨LOX 已達(dá)電泳純，分子質(zhì)量約為62 kDa，小于大豆LOX 的相對(duì)分子質(zhì)量(～96 kDa，見(jiàn)圖4 條帶1)。

如表1 所示，根據(jù)本文所建的純化方法，麻鴨LOX 的純化倍數(shù)可達(dá)98.64，但總體的酶活回收率較低，僅為5.3 %，酶活的損失主要發(fā)生在凝膠色譜和SOURCE 15Q 等精細(xì)純化階段。

表1 從麻鴨肌肉中純化麻鴨LOX 的結(jié)果Table 1 Results for the purification of LOX from shelduck muscle

2.2 麻鴨LOX 與大豆LOX 酶學(xué)性質(zhì)的比較

2.2.1 溫度對(duì)LOX 活力及穩(wěn)定性的影響

在10、20、30、40、50、60、70℃條件下分別測(cè)定麻鴨LOX 和大豆LOX 的活力，以酶活最高值為100%，計(jì)算不同溫度下的相對(duì)活力。結(jié)果如圖6 所示。麻鴨LOX 和大豆LOX 酶活力均隨著溫度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，麻鴨LOX 和大豆LOX 的最適作用溫度分別為30℃和40℃。

圖6 溫度對(duì)麻鴨、大豆LOX 活性的影響Fig.6 Effect of temperature on the activity of soybean LOX and shelduck LOX

進(jìn)一步考察麻鴨LOX 和大豆LOX 在不同溫度下的穩(wěn)定性。將酶液分別置于不同溫度(20 ～70℃)下保存30 min，取出測(cè)定酶活，以酶活初始值為100 %，計(jì)算不同溫度下的殘留活力，結(jié)果如圖7 所示。隨溫度的升高，麻鴨LOX 與大豆LOX 的殘留酶活均不斷下降。當(dāng)溫度＜50℃時(shí)，兩者的穩(wěn)定性差異不大，但當(dāng)溫度＞50℃后，大豆LOX 殘留酶活急劇下降，而麻鴨LOX 殘留酶活的變化則較為平緩。在70℃條件下保溫30 min，麻鴨LOX 仍可保留初始值的50.3 %左右，而大豆LOX 則已幾乎完全失活。

圖7 麻鴨LOX 和大豆LOX 的熱穩(wěn)定性Fig.7 Thermal stability of soybean LOX and shelduck LOX

2.2.2 pH 對(duì)LOX 活力及穩(wěn)定性的影響

設(shè)定溫度為37℃，在pH 4 ～10 分別測(cè)定麻鴨LOX 和大豆LOX 的活力，以酶活最高值為100%，計(jì)算不同pH 下的相對(duì)活力，結(jié)果如圖8 所示。麻鴨LOX 在酸性下表現(xiàn)出較高的活力，而大豆LOX 則在堿性下活性較高，其最適pH 值分別為6.0 和8.0。

圖8 pH 對(duì)大豆LOX 和麻鴨LOX 活性的影響Fig.8 Effect of pH value on the activity of soybean LOX and shelduck LOX

圖9 麻鴨LOX 和大豆LOX 的pH 穩(wěn)定性Fig.9 pH stability of soybean LOX and shelduck LOX

進(jìn)一步考察麻鴨LOX 和大豆LOX 的pH 穩(wěn)定性。將酶液分別置于pH 4 ～10 緩沖液中，于37℃下保存1 h，取出測(cè)定酶活，以酶活初始值為100 %，計(jì)算不同pH 下的殘留活力，結(jié)果如圖9 所示。麻鴨LOX 在中性和偏酸性條件下(pH ＜8.0)穩(wěn)定性較差，隨著pH 的升高，麻鴨LOX 的穩(wěn)定性明顯提高。經(jīng)pH 11 條件下處理1 h，麻鴨LOX 的殘余酶活高達(dá)初始酶活的90.6%，而此時(shí)大豆LOX 的殘余酶活僅為初始值的16.9 %。

2.2.3 NaCl 濃度對(duì)LOX 活力的影響

配制含NaCl 分別為0 %、1 %、2 %、3 %、4 %、5 % w/v 的底物溶液，分別測(cè)定麻鴨LOX 和大豆LOX 在不同NaCl 濃度下的相對(duì)酶活，結(jié)果如圖10 所示。NaCl 濃度對(duì)LOXs 酶活的影響比較復(fù)雜，隨著NaCl 濃度的升高，麻鴨LOX 和大豆LOX 活力總體上呈下降的趨勢(shì)，但在某一特定濃度下，麻鴨LOX 和大豆LOX 活力有明顯的上升。麻鴨LOX 在NaCl 濃度為2 %時(shí)達(dá)到最大活力，而大豆LOX 在NaCl 濃度為3 %時(shí)活力最高。

圖10 NaCl 對(duì)麻鴨、大豆LOX 活性的影響Fig.10 Effect of NaCl concentration on the activity of soybean LOX and shelduck LOX

2.2.4 金屬離子對(duì)LOX 酶活的影響

分別配制含不同濃度(1.0 mmol/L 和10 mmol/L)K+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+的底物溶液，按照1.3(2)的方法測(cè)定麻鴨LOX 在不同體系下的酶活，結(jié)果如表2 所示。

表2 金屬離子對(duì)麻鴨LOX 和大豆LOX 酶活的影響Table2 Effect of metal ions on the activity of shelduck LOX and soybean LOX

由表2 可知，在高、低兩個(gè)濃度條件下，Zn2+和Ca2+對(duì)麻鴨LOX 均具有較強(qiáng)的激活作用，其中Zn2+對(duì)酶活的激活作用尤為明顯，而Mn2+對(duì)麻鴨LOX 抑制作用較強(qiáng)。同樣的，Zn2+對(duì)大豆LOX 也具有較強(qiáng)的激活作用，而高濃度的K+、Mn2+和Cu2+對(duì)大豆LOX 的酶活具有一定的抑制作用。

3 結(jié)論

本文采用硫酸銨沉淀、DEAE sepharose FF 離子交換層析、Superdex 75 凝膠過(guò)濾以及SOURCE 15 Q離子交換層析的方法對(duì)麻鴨LOX 進(jìn)行了分離純化。在此基礎(chǔ)上對(duì)麻鴨LOX 的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，并與大豆LOX 進(jìn)行了比較，得到結(jié)論如下:

(1)采用硫酸銨沉淀、凝膠色譜和離子交換層析的方法得到了電泳純的麻鴨LOX，相對(duì)分子量約為62 kDa，比酶活為85714.3 U/mg，純化倍數(shù)為98.64。

(2)麻鴨LOX 和大豆LOX 的最適反應(yīng)溫度分別為30℃和40℃，最適作用pH 分別為6.0 和8.0，麻鴨LOX 的熱穩(wěn)定性和pH 穩(wěn)定性均優(yōu)于大豆LOX。

(3)低濃度的NaCl 對(duì)麻鴨LOX 和大豆LOX 的活力有一定的激活作用，在NaCl 分別為2 %和3 %時(shí)，麻鴨LOX 和大豆LOX 的活力最高。

(4)Zn2+和Ca2+對(duì)麻鴨LOX 均有的明顯的激活作用，而Mn2+對(duì)麻鴨LOX 具有強(qiáng)烈的抑制作用。

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