海洋膠原低聚肽的血管舒張和降膽固醇作用*

劉文穎，林峰，谷瑞增，魯軍，林單，蔡木易

(中國食品發酵工業研究院，北京市蛋白功能肽工程技術研究中心，北京，100015)

血管內皮細胞舒張功能損傷是動脈粥樣硬化、血栓性疾病及高血壓等的早期病變，以內皮細胞所分泌的一氧化氮(NO)減少而致血管舒張功能降低為其主要特征［1-2］。NO 是目前所知最強的內源性血管舒張因子，血管內皮細胞可通過釋放NO 松弛血管平滑?。?-4］。因此，通過提高NO 的分泌量，可以起到促進血管舒張的作用。體內過多的膽固醇會引起血脂偏高，進而誘發心腦血管疾病、老年癡呆癥、膽結石等疾病［5-6］。低密度脂蛋白受體(LDLR)和3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶(HMGCR)是膽固醇合成及轉運過程中的重要調控因子。通過提高LDLR 基因的表達、降低HMGCR 基因的表達，可以抑制膽固醇的合成［7-9］。治療血管內皮細胞舒張功能損傷或高膽固醇癥的藥物雖然效果顯著，但是長期服用具有一定的副作用。例如，臨床治療高膽固醇癥的藥物能夠降低膽固醇的合成速率，達到降低血脂的目的，但也具有肝、腎功能損害等毒副作用［3］。因此，尋找天然安全、具有生理活性的物質已成為當今研發的一大熱點。

海洋膠原低聚肽是以深海鮭魚的魚皮為主要原料，采用生物酶解方法生產的低聚肽混合物。本中心前期的研究結果表明，海洋膠原低聚肽具有較高的蛋白質含量(91.2%)，分子質量大多為1 000 Da 以下(90.8%)，主要集中在132 ～576 Da(69.3%)［10］。目前，對海洋膠原低聚肽的血管舒張和降膽固醇作用方面的研究尚未見報道。本實驗以人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)和人肝癌細胞株HepG2 為模型，探討海洋膠原低聚肽對HUVEC 細胞中NO 分泌量以及對HepG2 細胞內LDLR 及HMGCR 基因表達的影響，旨在闡明海洋膠原低聚肽的血管舒張活性和降膽固醇作用，為其開發和利用提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

海洋膠原低聚肽(以深海鮭魚的魚皮為原料，采用生物酶解方法制得的小分子肽類物質)，由北京中食海氏生物技術有限公司提供。

人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)、內皮細胞專用培養基，北京清源浩生物科技有限公司;人肝癌HepG2細胞，由北京師范大學細胞增殖與調控教育部重點實驗室提供;DMEM 培養基，美國GIBCO 公司;胎牛血清，杭州四季青公司;總一氧化氮檢測試劑盒，碧云天生物技術研究所;Trizol，美國Invitrogen 公司;反轉錄試劑盒，日本Takara 公司;Taq PCR StarMix 試劑盒，北京GenStar Biosolutions 公司。

1.1.2 儀器

CO2恒溫培養箱，德國Heraeus 公司;CKX41 倒置相差顯微鏡，日本Olympus 公司;iMark 酶標儀，美國Bio-Rad 公司;SmartSpec plus 核酸蛋白測定儀、MyCycler PCR 擴增儀、Gel Doc XR 凝膠成像系統，美國BIO-RAD 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

HUVEC 細胞培養于含2%胎牛血清的內皮細胞專用培養基中，HepG2 細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM 培養基中，在37℃、5%CO2培養箱中靜置培養。待細胞融合至培養皿的80%左右時，棄去培養液，用PBS 沖洗，加入適量0.25%胰蛋白酶消化，進行傳代。取處于對數期、生長狀態良好的細胞用于實驗。

1.2.2 海洋膠原低聚肽溶液制備及實驗分組

用PBS 溶液將海洋膠原低聚肽干粉配制成濃度為100 g/L 的母液，經0.22 μm 的微孔濾膜過濾后，放入-20℃冰箱中保存備用。用于血管舒張活性測定的細胞分組為:(1)對照組;(2)3g/L 海洋膠原低聚肽實驗組;(3)6 g/L 海洋膠原低聚肽實驗組;(4)9 g/L 海洋膠原低聚肽實驗組;(5)12 g/L 海洋膠原低聚肽實驗組。用于降膽固醇活性測定的細胞分組為:(1)對照組;(2)2 g/L 海洋膠原低聚肽實驗組;(3)4 g/L 海洋膠原低聚肽實驗組;(4)6 g/L 海洋膠原低聚肽實驗組;(5)8 g/L 海洋膠原低聚肽實驗組。

1.2.3 NO 含量的檢測

將HUVEC 接種于96 孔板中，細胞濃度為2.5 ×104個/mL，每孔100 μL。待細胞融合后，吸除培養液，加入100 μL 無血清的內皮細胞專用培養基，培養4 h 后，用不同濃度的海洋膠原低聚肽培養液處理細胞，同時設不加低聚肽的對照孔，每組6 個平行。分別于0、1 和2h 吸取培養液，使用總一氧化氮檢測試劑盒測定NO 含量。以KNO2為標準品，利用HUVEC細胞培養液將試劑盒中的10 mmol/L KNO2稀釋成2、5、10、20、50 μmol/L，制作標準曲線，參照試劑盒說明書測定培養液中的NO 含量。

1.2.4 反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)分析LDLR、HMGCR 基因表達的變化

1.2.4.1 引物設計

利用Primer Premier 5.0 軟件設計PCR 引物，引物均由美國Invitrogen 公司合成。PCR 上下游引物見表1，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)為內參基因。

表1 PCR 引物Table 1 Primers used in PCR analysis

1.2.4.2 細胞總RNA 提取

將HepG2 細胞接種于6 孔板中，細胞濃度為約5 ×104個/mL，每孔3 mL。待細胞融合至60%后，吸除培養液，用PBS 沖洗，加入3 mL 不含血清的DMEM 培養基，用不同濃度的海洋膠原低聚肽培養液處理細胞，同時設不加低聚肽的對照孔，每組6 個平行。培養24h 后，用胰酶消化，3 000 g 離心2 min收集細胞，棄上清液。加入1 mL DEPC 水溶解，3 000 g 離心2 min，加入1 mL Trizol 裂解細胞，轉移到1.5 mL 離心管中，充分裂解后，加入0.2 mL 氯仿，12 000 g 離心15 s，取上清液，加入0.5 mL 異丙醇，室溫靜置20 min 后，12 000g 離心10 min，棄上清液，緩慢加入1 mL 75%乙醇洗滌，7 500 g 離心5 min，棄上清液，空氣風干后加入20 μL DEPC H2O 溶解。利用核酸蛋白測定儀測定RNA 的濃度，取0.5 μg RNA 溶液用于RT-PCR 反應，剩余RNA 溶液置于-80℃冰箱中保存。

1.2.4.3 cDNA 合成

20 μL 體系中含有5 × Prime Script? Butter 4 μL，Oligo dT Primer 1 μL，Random Primer 5 μL，dNTP Mixture 2 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，PrimeScript?RTase 2 μL，DEPC 水以及RNA 溶液共5.5 μL。反應條件:25℃，10 min;42℃，60 min;4℃，∞。按反轉錄試劑盒說明書進行cDNA 合成，合成好的cDNA 置于4℃冰箱中保存待測。

1.2.4.4 RT-PCR 分析

20 μL 體系中含有重蒸水7 μL、2 × Taq PCR StarMix 10 μL、PCR 上游引物和下游引物混合溶液2 μL、反轉錄產物1 μL，充分混勻。反應條件為94℃預變性5 min，94℃變性30s，退火溫度53℃，30 s，72℃延伸30s 進行35 個循環，72℃延伸10 min 后4℃保存。取10 μL PCR 擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統上進行分析，以目的基因條帶與GADPH 條帶密度比值表示相應基因mRNA 的相對表達水平，實驗重復3 次。

1.2.5 統計學處理

實驗數據用ˉx±s 表示，采用SPSS 13.0 軟件進行統計學分析，組間比較采用t 檢驗，P ＜0.05，兩者有顯著性差異;P ＜0.01，兩者有極顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 海洋膠原低聚肽的血管舒張作用

2.1.1 NO 檢測的標準曲線

NO 是由血管內皮細胞產生的內皮衍生因子，是目前所知最強的內源性血管舒張因子，具有明顯廣泛的擴張血管作用，其生成減少或生物利用度的降低將導致血管阻力增加。血管舒張能力與產生NO 能力具有很強的相關性，一定量的NO 水平是重要的內源性細胞保護物質［1-4］。因此通過測定細胞培養液中NO 的濃度即可表征樣品的血管舒張活性［11-12］。NO檢測的標準曲線如圖1 所示，標準品的吸光值隨著濃度的增大而增大，成正比關系，擬合曲線為y =0.004x-0.009 3(R2=0.998 8)。

圖1 NO 檢測的標準曲線Fig.1 Standard curve of determination of NO

2.1.2 海洋膠原低聚肽對HUVEC 分泌NO 的影響

結果見圖2。與對照組相比，各實驗組細胞在海洋膠原低聚肽的作用下，NO 分泌量均有所增加，并且呈明顯的量效關系。海洋膠原低聚肽濃度為6 g/L時，NO 分泌量顯著性增加(P ＜0.05)，濃度為9 g/L、12 g/L 時，NO 分泌量極顯著性增加(P ＜0.01)。濃度為12 g/L 時，NO 含量增加最多。此外，由圖2 可知，不同濃度海洋膠原低聚肽作用2 h 后，NO 分泌量均比作用1h 有所降低。本項研究結果表明，海洋膠原低聚肽能顯著提高NO 含量，提示其具有調節血管舒縮功能、保護血管內皮細胞的作用。

圖2 不同濃度海洋膠原低聚肽作用下HUVEC 的NO分泌量，與對照組相比，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01Fig.2 The secretion of NO in HUVEC treated by different concentration of MCOP. Compared with the control，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01

Hirota 等［13］對2 種三肽VPP(Val-Pro-Pro)和IPP(Ile-Pro-Pro)的血管舒張作用進行了研究，結果表明2 種肽段在濃度為0.01 mmol/L 時，能顯著促進NO 分泌，提高NO 含量。本研究中的海洋膠原低聚肽是小分子肽的混合物，經分離純化后，可富集血管舒張活性高的肽段，明確對海洋膠原低聚肽的血管舒張活性起主要作用的肽段。

研究表明，肽的血管舒張活性與其ACE(血管緊張素轉化酶)抑制活性有一定的相關性，肽可通過輔助血管舒緩激肽起到ACE 抑制作用，通過B2 受體促進血管內皮細胞中NO 的分泌，從而起到舒張血管的作用［13］。Hirota 等的研究中便對VPP 和IPP 的兩種活性之間的相關性進行了探討。本中心前期已對海洋膠原低聚肽的ACE 抑制活性進行了研究，證實了其具有較強的ACE 抑制活性(半抑制濃度IC50值=1.165 ±0.087 mg/mL)［10］。關于海洋膠原低聚肽的血管舒張活性的作用機制需要進一步的研究。

2.2 海洋膠原低聚肽的降膽固醇作用

低密度脂蛋白受體(LDLR)和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶(HMGCR)是膽固醇合成及轉運過程中的重要調控因子。LDLR 是一種跨膜糖蛋白，具有維持血漿膽固醇水平恒定的作用。LDLR 減少，會導致血漿中低密度脂蛋白(LDL)攝取減少，進而導致血漿中LDLR 水平升高，使血膽固醇水平升高［14-15］。HMGCR 是膽固醇合成的限速酶，是膽固醇代謝的最重要的酶之一，能夠催化3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原生成甲羥戊酸，是整個膽固醇合成過程中的限速步驟［16］。因此，可通過增強LDLR 基因表達和降低HMGCR 基因表達，降低血膽固醇水平［17-18］。

本研究結果顯示，對HepG2 細胞分別加入2、4、6、8 g/L 海洋膠原低聚肽培養24h 后，與對照組比較，除2 g/L 海洋膠原低聚肽組外，其他實驗組的LDLR表達量均有上調(圖3 和圖4)。

圖3 海洋膠原低聚肽對HepG2 細胞LDLR、HMGCR mRNA 水平的影響Fig.3 The influence of MCOP on LDLR and HMGCR mRNA levels in HepG2 cells

圖4 海洋膠原低聚肽對HepG2 細胞LDLR mRNA相對表達水平的影響，與對照組相比，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01Fig.4 The influence of MCOP on the relative expression level of LDLR mRNA in HepG2 cells. Compared with the control，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01

4 g/L 海洋膠原低聚肽組的LDLR mRNA 表達增加最多，呈極顯著性差異(P ＜0.01)，是對照組的2.6倍。6 g/L、8 g/L 海洋膠原低聚肽組的LDLR mRNA表達顯著性增加(P ＜0.05)，分別是對照組的1.5、1.7 倍。各濃度海洋膠原低聚肽培養24 h 后，與對照組比較，HMGCR 的表達量均有下調，并有統計學差異(圖3、圖5)。2 g/L 海洋膠原低聚肽組的HMGCR mRNA 表達顯著性降低(P ＜0.05)，其余3 組的HMGCR mRNA 表達極顯著性降低(P ＜0.01)，其中6 g/L 海洋膠原低聚肽組的HMGCR mRNA 表達最低，大約降低了3/5。本研究結果表明，海洋膠原低聚肽能上調HepG2 細胞內LDLR mRNA 水平，下調HMGCR mRNA 水平，提示海洋膠原低聚肽可通過增強LDLR 的表達、抑制HMGCR 酶活性來降低細胞膽固醇合成。

圖5 海洋膠原低聚肽對HepG2 細胞HMGCR mRNA相對表達水平的影響，與對照組相比，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01Fig.5 The influence of MCOP on the relative expression level of HMGCR mRNA in HepG2 cells. Compared with the control，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01

近年的研究表明，LDLR 和HMGCR 的表達是通過固醇調節元件結合蛋白(SREBP)途徑調節的。在此途徑中，包括多個影響LDLR 和HMGCR 表達的因子和調控環節［19］。因此，海洋膠原低聚肽很可能通過SREBP 通路調控系統誘導LDLR 和HMGCR 基因表達，具體通過哪個因子、哪個環節進行調控，還有待進一步研究。

目前，關于肽類物質對膽固醇代謝影響的研究較少，現有的報道中大多是對植物提取物的相關研究，如Salleh 等［20］研究了多種從食用植物中提取的多酚物質對HepG2 細胞膽固醇代謝的影響，發現12 種多酚物質具有調節LDLR 表達的作用。本研究明確了海洋膠原低聚肽在調節膽固醇代謝方面的影響，為其開發利用提供了一定的理論依據。

3 結論

通過測定HUVEC 細胞培養液中NO 含量的變化，對海洋膠原低聚肽的血管舒張活性進行了研究。結果顯示，各實驗組細胞在海洋膠原低聚肽的作用下，NO 分泌量均有所增加，并且呈明顯的量效關系。濃度為12 g/L 時，NO 含量增加最多。不同濃度海洋膠原低聚肽作用2 h 后，NO 分泌量均比作用1h 有所降低。結果表明，海洋膠原低聚肽能顯著提高NO 含量，提示其具有調節血管舒縮功能、保護血管內皮細胞的作用。

通過觀察HepG2 細胞中LDLR 和HMGCR 表達的變化，對海洋膠原低聚肽的降膽固醇作用進行了研究。結果顯示，海洋膠原低聚肽培養24 h 后，除2 g/L 海洋膠原低聚肽組外，其他實驗組的LDLR 表達量均有上調，其中4 g/L 海洋膠原低聚肽組的LDLR 表達量增加最多;各實驗組HMGCR 的表達量均有下調，其中6 g/L 海洋膠原低聚肽組的HMGCR 表達量最低。結果表明，海洋膠原低聚肽能上調HepG2 細胞內LDLR mRNA 水平，下調HMGCR mRNA 水平，提示海洋膠原低聚肽具有降低細胞膽固醇合成的作用。

通過對海洋膠原低聚肽的血管舒張活性和降膽固醇活性的研究，為其開發利用提供了理論依據，但關于海洋膠原低聚肽中特征性活性肽段的進一步分離純化、鑒定以及促進血管舒張和降膽固醇的作用機制還有待于進一步研究。

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