大鼠腦出血周邊組織caspase-3表達和細胞凋亡的變化及促紅細胞生成素的影響

韓 鳳， 李叢言， 關(guān)雪蓮， 侯麗淳， 楊 慧

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是神經(jīng)科常見病，致殘率和死亡率高，嚴重地影響著人類健康。目前仍缺少有效的治療手段，出血性腦損傷不僅由于血腫的占位效應及血腫對周邊組織的直接破壞，繼發(fā)性損傷也是出血性腦損傷的主要原因。近期研究認為細胞凋亡是出血性顱腦損傷的重要機制之一［1］，本研究探討促紅細胞生成素(EPO)對大鼠腦出血周邊組織caspase-3表達及細胞凋亡的影響，為EPO治療腦出血提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 Wistar大鼠112只，雌雄不限，體重200～250g，由佳木斯大學實驗動物中心提供，實驗動物被隨機分為腦出血組、腦出血+EPO干預組各56只，兩組分別分為出血前、出血后4h、6h、12h、24h、72h、7d 這 7 個時間點，每時間點各 8只。

1.1.2 實驗藥品及試劑 原位凋亡檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。促紅細胞生成素購自山東阿華生物藥業(yè)有限公司。其它試劑為實驗室常用分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備及給藥方法 采用立體定向自體血腦內(nèi)注入法，按照包新民的《大鼠腦立體定位圖譜》［2］進行定位，參照牛國忠［3］報導的方法及Deinsberger W等［4］的方法改進。Wistar大鼠均經(jīng)10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉，大鼠俯臥固定于立體定位儀上，頭頂部剃毛消毒后正中矢狀切開，切口長約1.5cm，鈍性分離出前囟，在前囟后1mm，右旁4mm處用牙科鉆鉆一直徑約1mm小孔。腦出血組大鼠，距鼠尾末端約2cm處剪斷，取尾血50μl，將微量注射器推進至已鉆孔內(nèi)，進針5.5mm(相當于尾狀核部)后先注入10μl，停針2min后注入剩余40μl血液，2min后退針1.5mm停留7min之后緩慢將針完全退出。縫合皮膚，回籠飼養(yǎng)。腦出血前組只進針不注血。腦出血加EPO干預組與腦出血組前述操作相同，并于術(shù)后即刻、1h、3h、24h、48h、72h 分別腹腔注射 EPO3000U/kg，腦出血組、出血前組注射等量生理鹽水。大鼠清醒后無偏癱體征，或血液沿針道返流，或血液進入腦室者棄用。

1.2.2 caspase-3免疫組織化學染色 嚴格按照說明書步驟進行，在高倍光鏡下(×400)，每張切片計數(shù)血腫周邊不重疊5個視野陽性細胞數(shù)，計算平均值。

1.2.3 凋亡細胞的原位檢測 TUNEL染色程序按試劑盒內(nèi)的說明操作，細胞計數(shù)，高倍鏡下(10×40)每片在血腫周邊區(qū)、陽性細胞染色區(qū)隨機選取2個視野，計算每個視野下陽性細胞數(shù)，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 腦出血周邊組織caspase-3表達的變化腦出血后4h起，出血周邊腦組織caspase-3表達明顯增高(P＜0.01)，24h達高峰，治療組 caspase-3表達4h起也明顯增高(P＜0.01)，24h達高峰，治療組各時間點caspase-3表達明顯低于腦出血組(P＜0.01)(見表1)。

2.2 腦出血各組凋亡細胞計數(shù) 腦出血后12h起，出血周邊腦組織凋亡細胞數(shù)明顯增高(P＜0.01)，72h達高峰，治療組凋亡細胞數(shù)12h起也明顯增高(P ＜0.01)，72h達高峰，治療組 12h、24h、72h、7d凋亡細胞數(shù)明顯低于腦出血組(P＜0.01)(見表2)。

表1 腦出血后不同時間點caspase-3陽性細胞數(shù)表達的變化(個，;n=8)

表1 腦出血后不同時間點caspase-3陽性細胞數(shù)表達的變化(個，;n=8)

與腦出血前比較*P＜0.05;與腦出血對應時間點比較#P＜0.05

組別 腦出血組 EPO組腦出血前腦出血4h腦出血6h腦出血12h腦出血24h腦出血72h腦出血7d 1.23 ±0.39 18.12 ±3.56*30.28 ±3.19*49.25 ±5.32*75.36 ±5.27*58.13 ±4.82*26.17 ±3.45*1.44 ±0.47 16.29 ±4.11*18.12 ±3.98*#29.21 ±3.65*#40.19 ±4.02*#38.29 ±3.68*#16.21 ±2.97*#

表2 腦出血后不同時間點凋亡細胞數(shù)變化(;n=8)

表2 腦出血后不同時間點凋亡細胞數(shù)變化(;n=8)

與腦出血前比較*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與腦出血對應時間點比較#P ＜0.01

TUNEL 數(shù)組別腦出血組 EPO組腦出血前腦出血4h腦出血6h腦出血12h腦出血24h腦出血72h腦出血7d 1.75 ±0.61 1.99 ±0.78 2.28 ±0.60 23.16 ±2.79＊＊93.75 ±5.88＊＊185.30 ±10.53＊＊135.62 ±14.73＊＊1.83 ±0.64 2.14 ±0.68 2.11 ±0.76 18.23 ±1.35＊＊#63.85 ±3.85＊＊#89.98 ±9.67＊＊#61.32 ±3.00＊＊#

3 討論

腦出血是指原發(fā)性非外傷性腦實質(zhì)內(nèi)出血，是臨床常見病，目前仍沒有切實有效的治療手段，出血性腦損傷不僅由于血腫的占位效應及血腫對周邊組織的直接破壞，繼發(fā)性損傷也是出血性腦損傷的主要原因。近期研究認為細胞凋亡機制參與了腦出血的繼發(fā)性損傷，此機制為腦出血的防治提供了可能的新手段。神經(jīng)細胞凋亡是腦出血后致殘的重要原因，因此抑制腦出血周邊組織細胞凋亡的機制可能成為治療腦出血的新靶點。

細胞凋亡是由各種凋亡刺激信號始動，受細胞內(nèi)源性基因、酶類和信號傳導途徑等調(diào)控的“瀑布式”激活過程。近來凋亡機制的研究發(fā)現(xiàn)，caspase家族在凋亡過程中起重要作用，凋亡的最后過程是通過caspase的激活而實現(xiàn)的。細胞凋亡過程受多種基因的調(diào)控，caspase是一類天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶，而caspase-3是caspase家族中最重要的成員之一，是凋亡信號傳導途徑中重要的調(diào)控基因［5，6］。caspase-3為凋亡級聯(lián)反應的終末執(zhí)行酶，它的激活是細胞凋亡的最終共同途徑，caspase-3可以通過裂解DNA修復蛋白或者直接破壞蛋白質(zhì)、核酸和胞膜的結(jié)構(gòu)，使細胞發(fā)生凋亡。正常情況下caspase酶原沒有活性，必須通過激活，才能誘導凋亡。出血后啟動凋亡級聯(lián)反應的關(guān)鍵因素還沒有確定。有作者認為腦出血的鄰近組織受輕微缺血影響［7］，大量激活的血液成分在出血后涌入大腦，其中細胞因子被活化后可導致信號轉(zhuǎn)導介導凋亡［8］。促紅細胞生成素是一種主要產(chǎn)生于腎臟的細胞因子，主要用于治療貧血，EPO在缺血性腦血管疾病病理過程中具有保護作用。

EPO是一種多功能營養(yǎng)因子及神經(jīng)保護因子，功能性的EPO受體在多種組織和器官中都有表達。近年來發(fā)現(xiàn)應用EPO能減少神經(jīng)細胞凋亡，對缺血性腦損傷有保護作用［9～11］。外源性的EPO在腦缺血損傷下可以透過血腦屏障對抗缺血后的神經(jīng)凋亡起到腦保護作用［12，13］。EPO 對腦出血的研究目前尚少報導。

本研究采用分組、藥物干預及多時間點檢測caspase-3及凋亡細胞來探討EPO對腦出血的治療提供實驗依據(jù)。本實驗發(fā)現(xiàn)大鼠腦出血后，大鼠腦出血周邊組織caspase-3表達4h開始升高(P＜0.01)，大約24h左右caspase-3表達達峰值。大鼠腦出血周邊組織6h出現(xiàn)凋亡細胞，12h上升顯著(P＜0.01)，3d凋亡細胞達峰值，7d時仍存在較多凋亡細胞。EPO干預后，caspase-3表達及凋亡細胞與腦出血組對應時間點比較顯著下降(P＜0.01)。實驗提示EPO能抑制caspase-3在腦出血后的表達，提示EPO通過抑制caspase-3的表達，抑制了腦出血后神經(jīng)細胞的凋亡，減少受損神經(jīng)細胞的死亡，促進神經(jīng)細胞損傷后的恢復與存活，改善腦出血的預后，對腦出血后腦損傷有保護作用。

［1］Zhang XQ，Zhang ZM，Yin XL，et al.Exploring the optimal operation time for patients with hypertensive intracerebral hemorrhage:tracking the expression and progress of cell apoptosis of prehematomal brain tissues［J］.Chin Med J，2010，123(10):1246 －1250.

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