14-3-3γ過表達(dá)通過抑制LRRK2的去磷酸化防護(hù)魚藤酮誘導(dǎo)的多巴胺能細(xì)胞損傷

程道賓， 陳小武

14-3-3蛋白與α-synuclein在結(jié)構(gòu)上具有同源性，二者能相互作用并共存于Lewy體，提示14-3-3蛋白參與了帕金森病的發(fā)?。?，2］。研究發(fā)現(xiàn)14-3-3基因轉(zhuǎn)移對多巴胺能神經(jīng)元具有保護(hù)作用［3～5］。LRRK2(leucine-rich repeat kinase 2)與家族性及散發(fā)性帕金森病均有關(guān)［6］，然而LRRK2突變致帕金森病的機(jī)制仍不十分清楚。研究發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白亦與LRRK2相互作用［7］，它們的相互作用在帕金森病的發(fā)病中有何作用及意義尚不完全清楚。因此本實(shí)驗(yàn)擬通過過表達(dá)14-3-3γ蛋白，探討14-3-3蛋白與LRRK2相互作用在帕金森病發(fā)病中的作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 Ad/14-3-3γ的構(gòu)建、鑒定、擴(kuò)增與滴度測定 Ad/14-3-3γ的構(gòu)建與鑒定詳見文獻(xiàn)［8］。病毒儲存液在HEK293細(xì)胞(Clontech公司)中進(jìn)行反復(fù)擴(kuò)增，按Graham的方法［9］對重組腺病毒Ad/14-3-3γ上清采用氯化銫(CsCl)密度梯度離心法和透析法純化，采用改進(jìn)的TCID50法檢測病毒滴度。病毒滴度用蝕斑形成單位(plaque forming unit，pfu)/L表示，測得重組的Ad/14-3-3γ滴度為3.0×1012pfu/L。

1.2 PC12細(xì)胞的培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 野生型大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞(PC12)CCTCC。細(xì)胞接種于含5% 胎牛血清(Gibco)、10% 馬血清(Gibco)的高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco)中，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2及飽和濕度，2～3d換液，生長至70% ～80%豐度時，吹打細(xì)胞傳代。

按處理不同實(shí)驗(yàn)分為3組:(1)正常對照組:PC12細(xì)胞不加任何藥物處理;(2)魚藤酮組:PC12細(xì)胞加入新鮮配置的魚藤酮(終濃度為20nmol/L，Sigma公司)培養(yǎng)48h;(3)Ad/14-3-3γ組:用重組腺病毒Ad/14-3-3γ按感染復(fù)數(shù)MOI:25感染PC12細(xì)胞，48h后加入新鮮配置的魚藤酮(終濃度為20nmol/L)培養(yǎng)48h。

1.3 RT-PCR 檢測14-3-3 γ mRNA 表達(dá) 分別提取Ad-null和Ad/14-3-3 γ感染的PC12細(xì)胞及未加任何處理的PC12細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄和PCR，以β-actin作為內(nèi)參照。14-3-3γ引物由上海生工合成。上游引物序列為:5’GGAGGGTCATCAGTAGCATT3’，下游引物序列為:5’GCCAGGTAGCGGTAGTAGTC3’;合成的片段長度226bp。β-actin引物上游序列為:5’GTGGGCCGCTCAAGGCACCAA3’，下游序列為:5’CTTTAGCACGCACTGTAGTTTCTC3’，引物片段長度 540bp。β-actin PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 1μl、14-3-3γ PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2μl，經(jīng)過3%瓊脂糖凝膠電泳，條帶灰度值用圖像分析系統(tǒng)測定。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測PC12細(xì)胞凋亡率 采用annexin V-FITC/PI雙標(biāo)法，試劑盒購自上海鼎杰生物技術(shù)有限公司。調(diào)整細(xì)胞濃度至(0.5～1.0)×106/ml，每組各取1ml細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)按試劑盒說明操作。

1.5 激光共聚焦顯微鏡觀察14-3-3蛋白與LRRK2的免疫熒光雙標(biāo)染色 將細(xì)胞接種于24孔板中，細(xì)胞生長到70% ～80%豐度時，按分組分別處理。先用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30min，PBS洗5min×3次，再用牛血清白蛋白孵育30min;同時滴加兔抗14-3-3蛋白抗體(1∶200，Santa Cruz公司)和小鼠抗LRRK2抗體(1∶200，sigma公司)，4℃孵育過夜;PBS洗5min×3次，同時滴加FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶200，南京 Oddfoni公司)及 Texas Red標(biāo)記的驢抗鼠二抗(1∶200，南京 Oddfoni公司)37℃孵育1h;PBS漂洗后甘油封片，共聚焦顯微鏡下觀察、照相。

1.6 免疫印跡法檢測蛋白的表達(dá) 提取蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。取總蛋白20μg，15%SDSPAGE電泳，電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到NC膜上，NC膜在室溫下用5%脫脂牛奶-PBS封閉1h;兔抗14-3-3 γ抗體(1∶500，Santa Cruz公司)，兔抗LRRK2 p-Ser910 抗體及LRRK2 p-Ser935抗體(1∶500，Epitomics公司)或小鼠抗LRRK2抗體(1∶500，Epitomics公司)和小鼠抗γ-tubulin抗體(1∶10000，Sigma)4℃孵育24h;HRP標(biāo)記的羊抗兔(1∶5000，Pierce公司)或大鼠抗小鼠IgG(1∶4000，Sigma公司)室溫孵育2h;化學(xué)發(fā)光法顯影，掃描。用圖像處理系統(tǒng)對條帶灰度進(jìn)行分析，免疫印跡條帶按面積×灰度計(jì)算，每個樣本的免疫印跡條帶均與同一樣本的總LRRK2比較后作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測14-3-3γ mRNA的表達(dá) 各組間β-actin mRNA的表達(dá)無差異。Ad/14-3-3γ組14-3-3γ mRNA表達(dá)顯著高于正常對照組和Ad-null組(見圖1)。

2.2 Western blot檢測14-3-3γ蛋白的表達(dá)及LRRK2-Ser910及LRRK2-Ser935的磷酸化水平 與正常對照組相比，魚藤酮組14-3-3γ蛋白表達(dá)水平及LRRK2-Ser910與LRRK2-Ser935的磷酸化水平顯著下降，與魚藤酮組相比較，Ad/14-3-3γ組14-3-3γ蛋白的表達(dá)水平及LRRK2-Ser910與LRRK2-Ser935的磷酸化水平顯著增高(見圖2)。

2.3 免疫雙標(biāo)激光共聚焦顯微鏡對14-3-3γ蛋白與LRRK2相互作用的檢測 魚藤酮組14-3-3γ蛋白與LRRK2的結(jié)合與正常對照組及Ad/14-3-3γ組相比顯著減少(見圖3)。

2.4 流式細(xì)胞儀對PC12細(xì)胞凋亡率的檢測左下象限為正常細(xì)胞，左上象限為PI單標(biāo)記的壞死細(xì)胞;右下象限為Annexin V-FITC單標(biāo)記的早期凋亡細(xì)胞，右上象限為Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)的晚期凋亡細(xì)胞，早期和晚期的凋亡細(xì)胞合計(jì)為凋亡細(xì)胞。正常對照組細(xì)胞凋亡率為4.26% ±1.39%，魚藤酮組與正常對照組相比細(xì)胞凋亡率顯著增高(36.20% ±2.18%，P ＜0.01)，Ad/14-3-3γ 組細(xì)胞的凋亡率(12.78% ±2.96%)與魚藤酮組比較顯著降低(P＜0.05)(見表1)(見圖4)。

表1 流式細(xì)胞儀檢測PC12細(xì)胞的凋亡率(%，，n=3)

表1 流式細(xì)胞儀檢測PC12細(xì)胞的凋亡率(%，，n=3)

與正常對照組相比#P＜0.01;與魚藤酮組比較*P＜0.05，每組計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)1×104

93.67 ±3.58 59.42 ±3.26 87.75 ±5.43分組 凋亡細(xì)胞 壞死細(xì)胞 活細(xì)胞正常對照組魚藤酮組Ad/14-3-3 γ組4.26 ±1.39 36.20 ±2.18#12.78 ±2.96*1.55 ±0.72 1.49 ±0.91 1.37 ±0.73

圖1 腺病毒感染PC12細(xì)胞48h后RT-PCR檢測結(jié)果

圖2 Western blot檢測14-3-3γ蛋白的表達(dá)及LRRK2-Ser910及LRRK2-Ser935的磷酸化水平

3 討論

14-3-3蛋白因與α-synuclein具有同源性并共存于Lewy體中而提示其參與了帕金森病的發(fā)?。?，2］。我們的研究也顯示帕金森病大鼠模型及細(xì)胞模型中14-3-3蛋白表達(dá)水平明顯減少［10，11］，并且過表達(dá)14-3-3蛋白對多巴胺能神經(jīng)元具有保護(hù)作用［3～5］。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果亦顯示，通過腺病毒載體將14-3-3γ基因轉(zhuǎn)入PC12細(xì)胞能抵抗魚藤酮的毒性，降低PC12細(xì)胞的凋亡率(見圖4和表1)，對多巴胺能細(xì)胞具有保護(hù)作用。

圖3 免疫熒光雙標(biāo)激光共聚焦顯微鏡檢測14-3-3γ蛋白與LRRK2的相互作用

圖4 流式細(xì)胞儀檢測PC12細(xì)胞的凋亡率

最近的資料表明，LRRK2基因的突變與遺傳性帕金森病及散發(fā)性帕金森病均有關(guān)［6］，提示遺傳性及散發(fā)性PD可能有共同的發(fā)病機(jī)制，LRRK2可能是聯(lián)系二者的橋梁。目前LRRK2基因的突變導(dǎo)致帕金森病的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白能與LRRK2相互作用［7］，我們通過免疫雙標(biāo)的方法也證實(shí)了上述發(fā)現(xiàn)(見圖3)。LRRK2的Ser910及Ser935是與14-3-3蛋白結(jié)合的兩個主要位點(diǎn)［12］，我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在魚藤酮制作的PD細(xì)胞模型中，LRRK2的Ser910及Ser935的磷酸化水平顯著下降，而14-3-3 γ蛋白的過表達(dá)能顯著增加這兩個位點(diǎn)的磷酸化水平(見圖2)。有趣的是，LRRK2的幾個常見的突變位點(diǎn)都表現(xiàn)出 LRRK2的 Ser910及Ser935的磷酸化水平下降［13］。因此我們推測，14-3-3蛋白的過表達(dá)使其與LRRK2的Ser910及Ser935位點(diǎn)牢固結(jié)合，阻止LRRK2的p-Ser910及p-Ser935的去磷酸化，維持LRRK2酶的活性及正常生理功能。

總之，本實(shí)驗(yàn)提示14-3-3γ蛋白的過表達(dá)可能通過增加LRRK2的Ser910及Ser935的磷酸化水平，對魚藤酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的損傷發(fā)揮防護(hù)作用。

［1］Dougherty MK，Morrison DK.Unlocking the code of 14-3-3［J］.J Cell Sci，2004，117(10):1875 －1884.

［2］Berg D，Holzmann C，Riess O.14-3-3 proteins in the nervous system［J］.Nat Rev Neurosci，2003，4(9):752 －762.

［3］陳小武，孫圣剛，程道賓，等.14-3-3蛋白過表達(dá)減輕MPP+對PC12細(xì)胞的毒性損傷［J］.中華神經(jīng)科雜志，2007，40(2):76－79.

［4］陳小武，王 埮，袁昆雄，等.腺病毒載體介導(dǎo)的人14-3-3γ基因轉(zhuǎn)移對魚藤酮誘導(dǎo)的多巴胺能細(xì)胞損傷的保護(hù)作用［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2012，92(1):55 －59.

［5］陳小武，陳志斌，王 埮，等.腺病毒載體介導(dǎo)的人14-3-3γ基因轉(zhuǎn)移對帕金森病大鼠模型多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用［J］.中華老年醫(yī)學(xué)雜志，2012，31(11):1022 －1026.

［6］Mata IF，Checkoway H，Hutter CM，et al.Common variation in the LRRK2 gene is a risk actor for Parkinson’s disease［J］.Mov Disord，2012，27(14):1822 －1825.

［7］Li X，Wang QJ，Pan N，et al.Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson＇s disease［J］.PLoS One，2011，6(3):17153.

［8］陳小武，陳志斌，王 埮，等.人14-3-3γ基因的腺病毒載體的構(gòu)建及其在PC12細(xì)胞中的表達(dá)［J］.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2011，27(1):44－49.

［9］Graham FL，Prevec L.Manipulation on of adenovirus vectors.In:Murray EJ，Ed.Gene transfer and expression protocols，(Methods in molecular bloiogy，Vol.7)［M］.Clifton，NJ:Human apress，Inc.1991.109 －128.

［10］陳小武，孫圣剛，程道賓，等.14-3-3蛋白在PC12細(xì)胞的分布及MPP+對其表達(dá)的影響［J］.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2006，23(4):399－401.

［11］蘇慶杰，陳志斌，陳小武，等.H2O2預(yù)處理通過上調(diào)14-3-3蛋白表達(dá)減輕MPP+對PC12細(xì)胞的毒性作用［J］.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2008，25(4):388 －390.

［12］Dzamko N，Deak M，Hentati F，et al.Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935)，disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization［J］.Biochem J，2010，430(3):405 －413.

［13］Rautio J.Inhibitors of LRRK2 kinase activity to probe the treatment option in Parkinson’s disease［J］.J Med Chem，2012，55(22):9414－9415.