2012-2013年福建省豬流行性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查

林裕勝 王隆柏 吳學(xué)敏 周倫江* 邵良平

（1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 福州 350002；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 福州 350013）

豬流行性腹瀉（Porcine Epidemic Diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）引起的豬的一種急性、高度接觸性腸道傳染病，發(fā)生于各種年齡豬，其中對(duì)哺乳仔豬的危害最為嚴(yán)重，以腹瀉、嘔吐和脫水為臨床特征。1978年英國首次報(bào)道PED，并確定為一種冠狀病毒引起的疾病［1］。在之后2年，Debouck P等在許多國家和地區(qū)對(duì)該病進(jìn)行了血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果都檢測(cè)到PEDV 特異性抗體的存在［2］。我國于1980年首次分離到PEDV，以后許多地區(qū)均有PED 發(fā)生的報(bào)道，且流行范圍逐漸擴(kuò)大。崔現(xiàn)蘭等對(duì)26個(gè)省、市、自治區(qū)的調(diào)查表明，因PED 導(dǎo)致的豬死亡率占36 種豬病總死亡率的1.74%，同時(shí)PED 與TGE的混感率近年已上升至30.77%［3］。2011年甘海霞等應(yīng)用RT-PCR 對(duì)來自廣東省34個(gè)縣144個(gè)不同規(guī)模豬場(chǎng)的216 份臨床豬糞樣的檢測(cè)結(jié)果表明，很多豬場(chǎng)普遍存在TGEV和PEDV，尤其以PEDV 感染更為嚴(yán)重，陽性率達(dá)27.8%［4］。為了進(jìn)一步弄清福建省PEDV的分布和感染情況，2012-2013年上半年筆者對(duì)采自福建省62個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)128 份發(fā)生腹瀉的病料進(jìn)行了PEDV 病原學(xué)檢測(cè)，研究分析PEDV在豬群中的感染及流行規(guī)律，為豬流行性腹瀉的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣品 2012-2013年上半年采集福建省9個(gè)地級(jí)市62個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)的腹瀉樣品128 份，樣品組織經(jīng)剪碎、研磨，按1︰10 比例加TE 液稀釋，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 病毒RNA 提取試劑盒購置OMEGA 公司，病毒DNA 提取試劑盒購自ROCHE公司，PCR 擴(kuò)增試劑盒購置北京全式金生物科技有限公司，AMV 酶、dNTP和DNA Marker-2000 購自TaKaRa 公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank 中已發(fā)表的PEDV、TGEV、PROV的基因序列，設(shè)計(jì)合成檢測(cè)引物。PEDV的檢測(cè)引物，Up-5’-ATGTCTAACGGTTCTATTCCCGTTG-3’，Down-5’-TTAGACTAAA TGAAGCACTTTCTCA-3’，預(yù)期片段為563 bp；TGE V 檢測(cè)引物，UP-5’-CTTCTAAATGGCCAACCAGGG AC-3’，Down-5’-CGAGCATCTCGTTTAGTTCGTT-3’，預(yù)期片段為1 168 bp；PROV 檢測(cè)引物，Up-5’-GTATGGTATTGAATATACCAC-3′，Down-5’-GATC CTGTTGGCCATCC -3’，預(yù)期片段為342 bp；其他病毒引物參考文獻(xiàn)［5］進(jìn)行設(shè)計(jì)合成。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2.2 核酸提取 采用病毒RNA/DNA 提取試劑盒，參照操作說明，分別提取組織樣品的總RNA/D NA，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RT-PCR 或PCR 病原檢測(cè) 采用北京全式金生物科技有限公司RT-PCR 擴(kuò)增試劑盒，按照試劑盒提供的操作手冊(cè)配制反應(yīng)體系，RT-PCR 反應(yīng)體系：Total RNA 4μL、5×TransScriptTM All-in-One SuperMix for PCR 4μL、Rnase-free Water 12μL，反應(yīng)條件：25 ℃10 min，42 ℃30 min，85 ℃5 min。

PCR 反 應(yīng) 體 系：2×GoTaq Master Green Mix 12.5μL，上下游引物各0.5μL，cDNA 或DNA 模版3μL，無菌去離子水8.5μL，混勻后進(jìn)行擴(kuò)增，條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，53～61℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。取7μL 進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.4 PEDVORF3和M 基因遺傳進(jìn)化分析 選取3個(gè)豬群發(fā)病嚴(yán)重的規(guī)模豬場(chǎng)采集的陽性PEDV 病料，擴(kuò)增其ORF3和M 基因，將目的片段送生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序，采用DNAstar 軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEDV 檢測(cè)結(jié)果 對(duì)2012年至2013年上半年福建省各縣市采集的128 份腹瀉病料進(jìn)行PEDV、TGEV、PROV、CSFV、PRRSV和PRV 檢測(cè)。結(jié)果顯示：PEDV的陽性率為67.97%（87/128），其中PEDV和TGEV 混合感染為19.53%（25/128），PEDV和PROV 混合感染為3.91%（5/128），PEDV和PRV 混合感染為14.84%（19/128），PEDV 與PRRSV 混合感染為6.25%（8/128）。見表1，部分電泳圖見圖1。

表1 PEDV 檢測(cè)情況表

圖1 PEDV 檢測(cè)電泳圖

2.2 PEDV ORF3和M 基因遺傳進(jìn)化分析 分別對(duì)發(fā)病嚴(yán)重的豬場(chǎng)采集的陽性病料進(jìn)行了PEDV ORF3和M 基因擴(kuò)增，均能擴(kuò)增出目的片段。將陽性產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)序，獲得了3 株P(guān)EDV，命名為FJFZ、FJPT和FJ YX 毒株。通過軟件分析表明：3 株P(guān)EDV 在ORF3 基因劃分成2個(gè)主分支，其中FJFZ毒株與韓國毒株、中國大陸毒株處于一大分支，F(xiàn)JPT 毒株單獨(dú)于另一分支，F(xiàn)J YX 單獨(dú)處于一大分支，與attenuate DR13 弱毒株和致弱的CV777truncated 毒株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（見圖2）。3 株M 基因中以FJFZ 毒株和FJPT 毒株與CV777 標(biāo)準(zhǔn)毒株處于同于小分支，親緣關(guān)系較近，而FJYX 毒株單獨(dú)處于一大分支（見圖3）。

圖2 4 株P(guān)EDVORF3 基因核苷酸遺傳進(jìn)化樹

圖3 4 株P(guān)EDV M 基因核苷酸遺傳進(jìn)化樹

3 討論

1）2010年下半年以來，豬流行性腹瀉病毒造成了我國大量的小豬死亡，特別是對(duì)于飼養(yǎng)管理等條件不良的豬場(chǎng)，往往造成哺乳仔豬大量脫水、死亡。因此，該病成為嚴(yán)重影響我國養(yǎng)豬業(yè)健康的重要疫病之一。本次調(diào)查采集仔豬腹瀉病料的樣品，PEDV檢出陽性率高達(dá)60.8%，而且存在PEDV 與TGEV、PEDV 與PROV、PEDV 與PRV、PEDV 與PRRSV 混合感染，與臨近省市相比，福建省的PEDV 疫情相對(duì)嚴(yán)重，應(yīng)該引起養(yǎng)殖場(chǎng)的重視。

2）鑒于近年來PED 發(fā)病嚴(yán)重，能導(dǎo)致90%以上的發(fā)病哺乳仔豬死亡，而且具有防控難的特點(diǎn)，多數(shù)從業(yè)人員懷疑流行毒株是否發(fā)生了遺傳變異。因此，筆者分別從3個(gè)發(fā)生嚴(yán)重腹瀉的豬場(chǎng)采集了3 份病料進(jìn)行ORF3和M 基因序列測(cè)定，核苷酸遺傳進(jìn)化樹分析表明，3 株P(guān)EDV 毒株的ORF3 基因和M 基因均存在基因突變，其中FJ YX 毒株與CV777 親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，M 基因片段與CV777和泰國流行毒株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

［1］Pensaert M B，Debouck P.A New Coronavirus-like Particle Associated with Diarrhea in Swine［J］.Arch.Virol，1978，58：237-243.

［2］Debouck P，Pensaert M.Experimental Infection of Pigs with a New Porcine Enteric Coronavirus，CV 777［J］.Am J Vet Res，1980，41（2）：219-223.

［3］崔現(xiàn)蘭，馬思奇，王明，等.應(yīng)用免疫熒光法診斷豬流行性腹瀉的研究［J］.中國畜禽傳染病，1990（5）：20-24.

［4］甘海霞，梁晟，韋顯凱，等.2011年廣西豬群豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎調(diào)查［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33（10）：125-127.

［5］王隆柏，莊向生，周倫江，等.福建省規(guī)模豬場(chǎng)偽狂犬病流行病學(xué)調(diào)查與分析［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2008，35（11）：119-121.