微生物菌劑的構建及其在城市污水處理中的應用

張蘭河 ，田 宇 ，郭靜波 ，趙 可 ，唐同同 ，王立剛，馬 放

（1 東北電力大學化學工程學院，吉林 吉林 132012；2 東北電力大學建筑工程學院，吉林 吉林 132012；3 哈爾濱工業大學城市水資源與水環境國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150090）

生物強化技術[1]（bioaugmentation）通過向廢水處理系統中投加具有特殊功能的優勢菌種或采用基因重組技術產生的高效菌種，使其與自然菌群協同作用，可提高系統對污染物和有害物質的去除能力，優化系統的性能，近年來得到了廣泛的研究與應用。Britt等[2]研究發現，生物強化技術的實施使系統對生活污水中有機物的去除效率提高了36%。Wang等[3]采用高效混合菌群處理造紙廢水時發現，經過生物強化的SBR 系統比未經生物強化的系統所能承受的有機負荷高出30%。張文藝等[4]利用曝氣生物濾池生物強化技術考察重污染河水中的COD、NH4+-N等指標的情況，結果發現其去除率均達到85%以上，出水濁度大大降低，出水水質達到了地表水環境質量標準。肖學梅等[5]采用生物強化技術對石油化工業堿渣廢水中主要污染物（如COD、揮發酚等）的去除率都高于98%，大幅度提高了有機物的處理負荷，且無二次污染。由此可見，通過投加優勢菌種的生物強化技術可實現污染物的高效降解、提高有機負荷、縮短污泥馴化時間。生物強化技術結合其它生物治理技術已成為發展廢水生物治理技術的一種有效途徑[6]。

為了進一步提高污水處理的效果，本研究通過對吉林市污水廠活性污泥中的微生物進行了富集、分離和純化，篩選分離功能菌株，構建微生物菌劑。在此基礎上，考察了投加微生物菌劑的SBR 反應器處理實際城市污水的效能，并對SBR 中微生物的代謝活性和功能多樣性進行了分析。

1 實驗材料和方法

1.1 功能菌株的篩選與構建

分別利用葡萄糖、可溶性淀粉、乙酸鈉、食用油、甘氨酸和牛血清白蛋白作為微生物的唯一碳源和能源，篩選分離功能菌，構建微生物菌劑。富集、分離功能菌株的基礎液體培養基成分為：KH2PO4，1 g/L；MgSO4，1 g/L；NaCl，1 g/L；(NH4)2SO4，2 g/L；微量元素液，1 mL。在液體培養基中添加15～20 g 瓊脂即制成基礎固體培養基。其中，單一碳源的投加量分別為：葡萄糖，10 g/L；可溶性淀粉，10 g/L；乙酸鈉，10 g/L；食用油，10 mL；牛血清白蛋白，2 g/L；甘氨酸，10 g/L。微量元素液的成分為：FeSO4?7H2O，0.3 g/L；CuSO4?5H2O，0.038 g/L；MnSO4?H2O，0.169 g/L；ZnSO4?7H2O，0.115 g/L，H3BO3，0.116 g/L，CoCl2?6H2O，0.024 g/L；NaMo4?2H2O，0.017 g/L。所有培養基均采用高壓蒸汽滅菌，其中含有葡萄糖的培養基滅菌條件為115℃、15 min，其它培養基滅菌條件均為121℃、20 min。

功能菌的培養條件：培養基pH值為7.0，培養溫度為28℃，搖床轉速為140 r/min。利用COD去除率和微生物生長量作為指標篩選能夠高效降解有機底物的功能菌株，將篩選得到的功能菌群進行復配，構建高效微生物菌劑。

1.2 主要分析項目和檢測方法

水質指標的測定均參照《水和廢水監測分析方法》[7]中標準方法測定。COD 采用重鉻酸鉀法；TOC采用燃燒氧化-非色散紅外吸收法；TN 采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法；NH4+-N 采用納氏試劑分光光度法；MLSS、MLVSS 采用濾紙重量法；DO采用德國WTW 公司生產Oxi3310 型測定儀測定；pH值采用梅特勒-托利多公司生產的實驗室FE20pH 計測定。

好氧呼吸速率（oxygen uptake rate，OUR）是指單位量的活性污泥在單位時間里所消耗的氧氣的量，是鑒定廢水可生化性的重要指標；脫氫酶的活性 （triphenyltetrazolium chloride-dehydrogenase activity，TTC-DHA）在很大程度上能夠反映生物體的活性狀態，是考察污泥活性的一項重要指標。二者的測定方法均參照文獻[8]。

Biolog 法是一種根據不同類型微生物利用碳源情況不同的原理，反映微生物群落代謝功能的有效方法，能夠比較分析微生物群落水平的多樣性及群落特征的差異[9]。Biolog 分析方法參見文獻[10]。本研究通過考察活性污泥樣品對Biolog 公司ECO 板上31 種碳源的利用情況，對比了投加微生物菌劑的活性污泥系統與只投加活性污泥的系統中微生物群落在代謝及功能方面的差異。

1.3 SBR 裝置的運行

圖1 SBR 實驗裝置示意圖

采用3 套平行運行的SBR 反應器（SBR1、SBR2和SBR3）進行對比研究。SBR 采用透明有機玻璃制成，內徑15 cm，有效高度30 cm，有效工作容積2.5 L，實際工作容積0.5 L，利用硼砂曝氣頭作為微孔曝氣器，采用ACO-003 電磁式空氣泵曝氣，通過氣體流量計控制曝氣泵的進氣流量，攪拌速度140 r/min。pH 電極、DO 電極置于反應器內，實時監測各項指標的變化。采用KG316T時間繼電器控制每個運行周期反應時間。為了分析和取樣方便，反應器設置3個取樣口，底部設有排泥口。SBR 運行周期為8 h，瞬間進水→曝氣6 h→靜置2 h→瞬間排水，進出水為城市污水，通過換水量的增減調整進水負荷。反應器溫度控制在28℃左右，pH值在7.0～7.2 之間，DO 在3～5 mg/L 之間，污泥停留時間為20 天。其中，SBR1 只投加微生物菌劑（投加量0.03 g/L）；SBR2 只投加活性污泥（投加量0.6 g/L）；SBR3 同時投加活性污泥和所構建的微生物菌劑。

2 結果與討論

2.1 功能菌株的篩選與特性

分別利用葡萄糖、可溶性淀粉、乙酸鈉、食用油、甘氨酸和牛血清白蛋白作為微生物的唯一碳源和能源，分離篩選得到23 株功能菌。其中，葡萄糖代謝功能菌5 株，分別記作P1、P2、P3、P4和P5；可溶性淀粉代謝功能菌5 株，分別記作K1、K2、K3、K4和K5；乙酸鈉代謝功能菌3 株，分別記作C1、C2和C3；食用油代謝功能菌3 株，分別記作Z1、Z2和Z3；甘氨酸代謝功能菌4 株，分別記作G1、G2、G3和G4；牛血清白蛋白代謝功能菌3株，分別記作N1、N2和N3。

利用COD和菌濁作為主要指標，考察了不同功能菌在單一底物條件下，在SBR 反應器中連續接種培養3 次的底物利用和菌株生長的情況。3 次培養的平均結果如表1所示。由表1 可以看出，葡萄糖代謝功能菌的降解效能優劣順序為P1＞P3＞P5＞P4＞P2；可溶性淀粉代謝功能菌的降解效能優劣順序為K2＞K4＞K5＞K3＞K1；乙酸鈉代謝功能菌的降解效能的優劣順序為C3＞C2＞C1；食用油代謝功能菌的降解效能的優劣順序為Z2＞Z1＞Z3；牛血清白蛋白代謝功能菌的降解效能的優劣順序為N1＞N3＞N2；甘氨酸代謝功能菌降解效能的優劣順序為G4＞G1＞G3＞G2。因此，初步確定用于微生物菌劑構建的菌株為P1、P3、K2、K4、C3、C2、Z2、Z1、N1、N3、G4和G1，并在功能菌群的復配中進一步驗證其效能及生長情況。

表1 功能菌株的污染物代謝能力及生長情況

表2 優勢菌的篩選結果

2.2 同類功能菌群的復配與構建

通過同類功能菌混合正交實驗，考察功能菌對不同底物的代謝能力，其主因子順序及最佳配比如表2所示。正交實驗結果表明，每類功能菌群中起關鍵主導作用的菌株分別為P1、P3、K2、K4、C2、C3、Z1、Z2、G1、G4、N1和N3，與6 類功能菌株的污染物代謝能力研究結果相一致。通過考察不同配比條件下功能菌群對相應底物的降解和生長情況，獲得同類功能菌群的最佳質量配比為P3∶P1=1∶1，K4∶K2=1∶1，C2∶C3=1∶1，G1∶G4=1∶1，Z2∶Z1=2∶1，N3∶N1=1∶1。

圖2 不同功能菌群配比下微生物菌劑對城市污水的處理效果

利用城市污水作為底物，采用正交實驗L25(56)，考察了不同功能菌群組合比例下微生物菌劑對TP、TN、TOC等污染物指標的去除效果，結果如圖2所示。由圖2 可知，當功能菌群配比為Z∶P∶G∶K∶N∶C=2∶3∶5∶1∶4∶2時，活性污泥對實際污水中TP、TN、TOC的去除率達到最高，分別為93.82%、96.00%和82.57%，且極差分析結果表明各類功能菌群的降解能力大小排序為Z＞P＞G＞K＞N＞C。在TP、TN和TOC 三個指標的處理效果上，食用油代謝菌對其去除率最高，乙酸鈉代謝菌對其去除率最低；甘氨酸代謝菌對污水中TOC的去除率相對較低，則在復配中所需投加量增加；可溶性淀粉代謝菌對TOC的去除率較高，則在復配中所需投加量較少。由此可見，由6 類功能菌構建的微生物菌劑對污水中有機污染物具有良好的降解效能，并在極短的適應期后使整個處理系統穩定運行，最后將功能菌群最佳復配比例確定為Z∶P∶G∶K∶N∶C=2∶3∶5∶1∶4∶2。

2.3 微生物菌劑對城市污水中有機物去除效果及脫氮效果的影響

COD 作為衡量水體有機污染物污染程度的重要指標，只能將部分有機物質氧化；TOC 采用燃燒法測定，能將水中有機物全部氧化，因此，采用COD和TOC 作為主要指標，考察微生物菌劑對城市污水中有機污染物的去除效果。

SBR1、SBR2、SBR3的進水容積負荷及出水水質情況如圖3所示。從圖3 可知，隨著反應器的運行，在進水容積負荷從0.57 kgCOD/(m3·d)增加到1.01 kgCOD/(m3·d)的過程中，SBR1的出水中COD濃度波動較大，進水負荷對出水效果影響顯著；SBR2的出水中COD 及TOC 濃度相對穩定，但均大于SBR3；SBR3的出水效果最好，耐沖擊負荷能力最強，系統運行穩定。其原因可能是：①SBR3中投加的活性污泥本身活性較高，適應城市污水環境能力強，同時為微生物菌劑的生長提供良好的載體，使微生物菌劑在污水中的適應期相對縮短[11]；②微生物菌劑與活性污泥同時投加有利于各菌群協同共生，形成微生物群落結構穩定且多樣性較高的生態系統[12]，從而增加了系統對有機物的降解效能。傳統的脫氮工藝基于硝化作用和反硝化作用的結合，由有機氨氮化、硝化、反硝化及微生物同化4個過程共同作用完成。本研究考察了SBR1、SBR2、SBR3 出水NH4+-N 與TN 濃度的變化，結果如圖4所示。從圖4 可以看出，隨著反應器的運行，在進水容積負荷從0.57 kgCOD/(m3·d)增加到1.01 kgCOD/(m3·d)的過程中，SBR1、SBR2、SBR3三個系統運行期間出水NH4+-N 及TN 濃度均下降，但是SBR3 出水效果最好，優于SBR1和SBR2。

這可能是由于：①在SBR 反應器中，運行初期微生物膠團外表面含有較高濃度的溶解氧，與異養菌相比，氨化菌和硝化菌在系統中占有優勢；隨著反應的進行及溶解氧的消耗，反硝化菌逐漸占優勢，異養菌經過適應期與系統中微生物群落產生協同作用，因此對污水中有機物及氮的去除效果越來越好[13]；②在SBR2和SBR3 中投加的活性污泥本身活性較高，對污水環境有較強的適應能力，能夠與微生物菌劑形成復雜而穩定的生態系統，從而提高脫氮效果；③從構建微生物菌劑的正交實驗結果可知，微生物菌劑本身對營養物質有較高的降解利用能力，但單獨投加微生物菌劑的系統中缺乏微生物附著場所，所以微生物生長繁殖受到限制，同時，進水負荷的增加使水流剪切力增大，因此SBR1 中微生物流失嚴重，脫氮效果不佳[14]。

2.4 微生物菌劑強化系統的代謝活性和菌群多樣性分析

OUR 通過測定污泥的呼吸速率能夠間接表征活性污泥的生理狀況和代謝活性，脫氫酶是微生物降解有機污染物和獲得能量的必需酶[15]，TTC-DHA直接關系到有機物降解速度及生物處理設施的運行效果[16]。因此，采用OUR和TTC-DHA 表征污泥生物活性的大小。

好氧呼吸速率計算公式如式（1）。

式中，OUR為單位質量污泥在單位時間內利用的氧量，mgO2/(gMLVSS·h)；t1為初始時間；t2為末時間；DO1為t1時刻溶解氧濃度，mgO2/L；DO2為t2時刻溶解氧濃度，mgO2/L；MLVSS為污泥濃度，mg/L。

脫氫酶的活性（TTC-DHA）的計算如式（2）。

式中，X為脫氫酶活性，TFμg/(gMLVSS·h)；A為在已知標準曲線中根據吸光度（OD）值算得的TF 含量；B為實際反應時間，h；C為測OD時試樣所稀釋的倍數。

SBR 中污泥生物活性的對比實驗結果如表3所示。由表3 可知，SBR3 中表征污泥生物活性的OUR和TTC-DHA 數值均高于SBR2。閆怡新等[17]研究了利用低強度超聲波強化污水生物處理中超聲處理污泥比例的影響，發現在污泥比例為10%的條件下，OUR 提高了12%，OUR 最大值為9.0mgO2/(gMLVSS·h)時，SBR 反應器對有機物的去除率提高了5%。張良等[18]對太原市第二焦化廠曝氣池活性污泥中篩選出的優勢菌株進行了TTC-DHA 測定，發現經固化后投入活性污泥和優勢混合菌的反應器中TTC-DHA的平均值為26.715 TFμg/(gMLVSS·h)，有機物去除效果最好，COD 去除率最大可提高22.6%。本研究與閆怡新、張良等的實驗結果相似，SBR3的OUR 及TTC-DHA值預期研究結果相近，實現了對有機污染物的高效去除。SBR3 中微生物生長能力強、代謝活性高、降解有機物的能力強[19]，SBR3 運行效果優于SBR2。

利用Biolog比較分析微生物群落水平的多樣性及群落特征的差異，AWCD 可以評判微生物群落的碳源利用能力，指示微生物代謝活性；Shannon 指數可以表征微生物群落豐富度，Simpson 指數評估微生物群落優勢度，McIntosh 指數反映微生物群落均勻度[20]。Biolog 分析結果如表4所示，SBR3 中微生物群落的Shannon 指數、Simpson 指數及McIntosh 指數都大于傳統未經生物強化的SBR2，且標準差較小。因此，經生物強化的SBR3 中活性污泥的代謝活性優于未經生物強化的SBR2 中的活性污泥[21]，SBR3 中微生物群落比SBR2 有較高的生物群落多樣性和碳源利用能力[22]，即SBR3 中能利用有關碳底物的微生物數量較多，且微生物群落反應速度均優于SBR2，有較好的群落物種均一性[23]。

表3 SBR2和SBR3 中污泥生物活性對比實驗結果

表4 SBR2和SBR3 中微生物群落功能多樣性的變化

3 結論

本研究中構成微生物菌劑的高效菌株均來源于受污染環境，該菌劑的環境安全性較好。通過SBR 運行效果及微生物代謝活性和菌群結構分析，投加生物菌劑的生物強化系統處理能力高且代謝活性強，在提高系統處理效率的同時降低了處理費用。因此，通過微生物菌劑的投加實施生物強化，為城市污水處理提供了新的研究思路。主要結論如下。

（1）通過對篩選到的6 類優勢功能菌株的正交實驗分析，得出對城市污水有機物降解效率高、環境適應能力強的微生物菌劑的最佳配比為Z∶P∶G∶K∶N∶C=2∶3∶5∶1∶4∶2。

（2）微生物菌劑與活性污泥的結合可實現其效能的有效發揮，生物強化提高了系統對有機物的處理效果、抗沖擊負荷能力、微生物生長能力和代謝活性，優化了微生物群落結構。

（3）采用人工復配的方法，從環境中篩選功能菌株，構建微生物菌劑，實施生物強化技術提高城市污水處理廠的綜合處理能力在理論及實踐上是可行的。

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