青藏高原禽源多殺性巴氏桿菌ompH基因的克隆及序列分析

安 娜，張紅見，劉光輝，趙 靜，陳 剛

（青海大學農牧學院，青海 西寧 810003）

禽霍亂是由多殺性巴氏桿菌引起的雞和火雞等禽類的一種接觸性傳染病。目前控制多殺性巴氏桿菌病的疫苗主要有強毒的滅活菌苗，弱毒活菌苗，這些疫苗在一定程度上對多殺性巴氏桿菌病的防治起到了一定的作用，但因多殺性巴氏桿菌的毒力因子具有多樣性、血清型多、免疫譜窄、保護期較短以及易產生耐藥性等原因［1］，以致本病仍未能得到有效的控制，特別是在青海省每年都有散在發生，造成了較大的經濟損失。

外膜蛋白H是多殺性巴氏桿菌最主要的外膜蛋白，屬于孔蛋白，其所具有的性質均提示孔蛋白能夠成為既能誘導機體產生同源保護又能產生異源保護的一種良好的候選疫苗［2］。本試驗選擇禽源多殺性巴氏桿菌分離株的ompH基因作為研究對象，以期了解青藏高原禽源Pm與其他菌株在遺傳特點、進化規律上的關系，以及ompH應用于疫苗的可行性，為研制更為有效的禽類地方血清型亞單位疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株 標準菌株：C47-8（牛源），購自中國獸醫藥品監察所；野生菌株分離自西寧市某雞場病死雞肝臟；對照菌株：肺炎克雷伯氏菌（ATCC700603）、大腸埃希菌（ATCC25922）、傷寒沙門菌（ATCC 14028），均由中國農業大學預防獸醫學教研室饋贈。

1.2 引物設計與合成 根據GenBank上公布的多殺性巴氏桿菌ompH基因保守序列，采用Primer Premier 5.0軟件，設計合成了1對引物ompH3，引物 序 列 如 下：Forward Primer 5′-AGCAGTAGCAGCAACTTCAGCAAA-3′；Reverse Primer 5′-CCC-GCACCTAAGATGATAGCACGA-3′，目 的基因片段長度928bp，由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.3 菌株模板DNA的抽提 C47-8、對照菌及P1004模板DNA的抽提操作步驟依照TaKaRa公司生產的MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit使用說明書進行。

1.4 PCR反應條件及體系 PCR反應體系：50μL反應體系：加入Premix Taq25μL，Forward Primer 1μL，Reverse Primer 1μL，模板 DNA 1μL，ddH2O 22μL。PCR反應條件：94℃5min，94℃30 s，72℃1min，72℃10min，4℃5min共30個循環，PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 P1004ompH基因的克隆 將回收的擴增片段連接到pMD18-T載體，轉化入DH5α感受態細胞，涂布于含氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養12～16h，將疑似陽性克隆的白斑選出，轉接到新的Amp＋的平板中37℃培養12h，將經過PCR鑒定的陽性克隆菌液送往上海英駿生物技術有限公司測序3次，將禽源Pm的ompH序列與GenBank上公布的C47-8及9個國內外代表株進行同源性分析。

2 結果

2.1 ompH基因的擴增 用自行設計的ompH3引物對標準菌株C47-8、陰性對照菌株肺炎克雷伯氏菌、大腸埃希菌、傷寒沙門菌和P1004進行ompH基因的PCR擴增，得到與預期結果相符的928bp的目的片段，作為陰性對照的肺炎克雷伯氏菌、大腸埃希菌和傷寒沙門菌均未擴出（見圖1、圖2）。

2.2 P1004ompH基因的鑒定 將回收后的P1004株和C47-8菌株的PCR產物與pMD18-T連接，轉化DH5α感受態細胞，隨機挑取單個白色菌落，轉接到新的Amp＋的平板中37℃培養12h后，進行PCR鑒定，均擴增到了預期的片段，然后送往上海英駿生物技術有限公司測序。

2.3 測序及同源性分析

2.3.1 禽源P1004ompH基因編碼區核苷酸及推導的氨基酸序列與標準菌株及國內外代表株同源性比較結果，見表1。

將禽源多殺性巴氏桿菌ompH基因編碼區核苷酸及推導的氨基酸序列與標準菌株及國內外代表株同源性進行比較，結果禽源P1004菌株和標準菌株C47-8之間的ompH基因編碼區核苷酸及推導的氨基酸序列的同源性分別為62%和91.7%，表明此次分離的禽源Pm菌株ompH基因序列與標準菌株C47-8之間存在明顯差異；禽源多殺性巴氏桿菌P1004ompH基因序列與GenBank中公布的國外代 表 毒 株 AY603962、AY864815、DQ054529、DQ415729、EF635423、DQ417895、EU016232、U50907和PMU52200的同源性在55.9%～65.2%之間，其中最低的是與PMU50907，同源性為55.9%；最高的是DQ417895，同源性也僅為65.2%。以上分析結果顯示，禽源多殺性巴氏桿菌P1004ompH基因編碼區核苷酸序列同源性與國內外大部分多殺性巴氏桿菌菌株ompH基因編碼區核苷酸序列同源性差異較大。

2.3.2 ompH基因編碼區核苷酸與其推導的氨基酸序列比較結果 經核苷酸序列比較，結果顯示，P1004和C47-8的序列差別很大，在第129等141個位點上都存在變異，在506～507位點發生基因缺失；與國內代表株AY864815和EF635423相比，在第54位等92個位點發生突變，506～507位上出現基因缺失；與國外代表株AY603963和DQ054529相比，在第88位等79個位點發生突變，在506～507位基因缺失；由圖3可知，將P1004和C47-8 ompH基因推導的氨基酸序列比較分析，顯示其氨基酸序列與C47-8同源性較高，為91.7%。在第21位等25個位點發生變異，在第66位等134個位點發生基因缺失；與國內代表株AY864815和EF635423相比，在21、72、128、135～136、157位發生變異，在66～68、170～298位發生缺失；與國外代表株AY603963和DQ054529相比，在第21位等22個位點發生變異，在170～298位發生基因缺失。

表1 11株多殺性巴氏桿菌ompH基因編碼區核苷酸及推導的氨基酸序列同源性

圖3 11株多殺性巴氏桿菌ompH基因編碼區推導的氨基酸序列比對圖

3 討論

3.1 據報道，純化的ompH能誘導100%保護率，與全菌誘導的保護率相當［3］；ELISA檢測結果表明，ompH和全菌都能誘導高水平的抗體。在同種菌的不同菌株中，孔蛋白的一級氨基酸序列、二級結構及與抗原性有關的區域相對保守［4］，ompH蛋白的這一特性為多殺性巴氏桿菌的鑒定及保護性抗原片段的篩選提供了一個新的方向，使ompH有望成為一種對所有血清型的Pm產生保護的候選抗原。

3.2 曹素芳等曾將血清A群的禽巴氏桿菌C48-1株ompH基因與已知的15個血清型及疫苗株CU的核苷酸及其推導的氨基酸序列比較，核苷酸同源性在51.5% ～98.7%之間，氨基酸同源性在39.3%～98.7%之間［1］.本試驗中P1004和標準菌株C47-8的ompH基因編碼區核苷酸序列的同源性為62%，氨基酸序列的同源性為91.7%；與已知的9個國內外代表株進行比對分析，核苷酸同源性在55.9%～65.2%之間，說明禽源Pm ompH基因編碼區核苷酸序列同源性與國內外大部分Pm菌株ompH基因編碼區核苷酸序列同源性差異大。但是氨基酸序列比較結果顯示，不同血清型菌株的ompH同源性很高，在91.3%～91.7%之間，提示ompH作為疫苗使用可能提供同源和異源保護，但有待進一步進行表達及免疫保護試驗研究。

［1］王娉，張富春.多殺性巴氏桿菌毒力因子的研究進展［J］.地方病通報，2006，21（2）.

［2］Luo Y，Glisson J R，JackwoodM W，et al.Cloning and characterization of the major outermembrane p rotein gene（om pH）of Pasteurella m ultocida X-73［J］.J Bacteriol，1997，179：7856-7864.

［3］Galdiero M，Folgore A，Nuzzo，et al.Adhesion and Transmigration Through Bovine Endothelial Cells in vitro by Protein H and LPS of Pasteurella m ultocida［J］.Immunobiology，2000，202（3）：226-238.

［4］曹素芳，黃青云，韓先干，等.禽巴氏桿菌C48-1外膜蛋白H基因克隆及序列分析［J］.中國預防獸醫學報，2006，28（3）：253-256.