薏米酒發酵前淀粉液化及糖化條件的優化

郭克娜，姜璐璐，闞建全,,*

(1.西南大學食品科學學院，重慶 400716；2.重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400716)

薏米(Coix lachryma-jobi)，又名薏苡仁、苡米、米仁，是我國民間傳統的中藥，也是一種膳食佳品。《本草綱目》謂其“健脾益胃、補肺清熱、祛風勝濕、養顏駐容、輕身延年”。大量研究報道表明，薏仁提取物薏仁油、薏仁酯、薏仁多糖等有很強的生物活性，如健胃、消炎、利尿、止痛、降血糖、抗癌等[1-7]。近年來隨著保健食品的風行，國外特別是日本對薏米進行了較為深入的研究和開發。但是雖然以薏米為原料的營養食品、藥膳佳肴層出不窮，但對薏米酒的研究和生產卻少見報道。主要由于薏米淀粉顆粒較大，且不易α化[8-9]，如果不將薏米淀粉進行充分液化和糖化就進行酒精發酵，再加上薏米本身的特殊氣味，研制出的薏米酒往往因為感官質量上的缺陷不能被大多數消費者所接受，因此無法實現商業化生產。所以在酒精發酵之前，對薏米原料的液化和糖化工藝進行研究，保證薏米酒發酵的品質與穩定性就顯得非常重要。本實驗通過對薏米淀粉進行水解，研究液化和糖化工藝的最優條件，旨在為后期薏米的酒精發酵提供數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薏米，市售，選用顆粒飽滿，無發黃無霉變的薏米，在高速粉碎機中粉碎后過40目標準篩，備用。

α-淀粉酶(酶活力3700U/g)、糖化酶(酶活力10萬U/g) 北京奧博星生物技術有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 薏米淀粉水解工藝流程

1.2.1 液化工藝流程

1.2.2 糖化工藝流程

1.3 分析方法

1.3.1 薏米主要成分的測定方法

淀粉：酸水解法[10]；粗蛋白：微量凱氏定氮法[10]；粗脂肪：索氏抽提法[10]；粗多糖：比色法[10]；水分測定：卡爾·費休法[10]。

1.3.2 水解液相關指標的測定方法

還原糖(以葡萄糖計)測定：斐林試劑法[10]；溶液相對密度：密度計法；DE值[11]：又叫葡萄糖當量值，是還原糖(以葡萄糖計)占溶液中干物質的百分比，計算公式如下：

1.3.3 薏米淀粉液化工藝試驗設計[12-19]

將薏米粉按料液比1：10(m/V)糊化后，進行液化工藝的優化。單因素試驗基本條件定為α-淀粉酶添加量1%、pH 6.5、溫度70℃、液化時間3h。改變其中一個條件，固定其他條件以分析各因素對液化效果的影響。各因素梯度分別為α-淀粉酶添加量0.25%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%；pH 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0；溫度55、60、65、70、75、80℃；液化時間1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5h。

通過單因素試驗確定4個因素的合適水平范圍，再選取L9(34)正交表，以液化DE值為考核指標，設計了四因素三水平的正交試驗，以確定液化最優條件組合。以上試驗每個處理重復3次，結果取平均值。

1.3.4 薏米淀粉糖化工藝試驗設計

在最佳液化工藝條件下進行糖化工藝的優化。單因素基本條件設定為糖化時間3h、糖化酶添加量1%、溫度60℃、pH4.5。改變其中一個條件，固定其他條件以分析各因素對糖化效果的影響。各因素梯度分別為糖化時間1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5h；糖化酶添加量0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%；溫度45、50、55、60、65、70℃；pH 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0。

在單因素試驗的基礎上，選取L9(34)正交表，以糖化DE值為考核指標，設計了四因素三水平的正交試驗，以確定糖化最優條件組合。以上試驗每個處理重復3次，結果取平均值。

1.4 數據分析處理方法

采用Origin Lab Origin Pro v7.5軟件進行數據制圖和統計分析。

2 結果與分析

2.1 薏米主要成分的分析結果

表 1 薏米主要成分Table 1 Major components of coixseeds

由表1可知，薏米中含量最高的成分是淀粉，此外薏米是禾本科一年生草本植物中蛋白質及脂肪含量較高的一類，其蛋白質含量比稻米約高出2倍[4]，脂肪含量是稻米的6倍左右。而薏米中重要的生理活性成分薏仁多糖的含量也非常可觀。

2.2 薏米淀粉液化最佳工藝條件的確定

2.2.1 α-淀粉酶添加量對液化液DE值的影響

圖 1 α-淀粉酶添加量對液化液DE值的影響Fig.1 Effect of α-amylase amount on DE of liquefaction

由圖1可知，隨著α-淀粉酶添加量增加，DE值迅速升高；但當加酶量大于2.00%時，DE值基本趨于穩定。這是由于加酶量小于2.00%時，底物質量濃度大于淀粉酶的質量濃度，反應速率受加酶量的影響較大，DE值隨著加酶量的增加而快速增大；加酶量大于2.00%時，隨著酶質量濃度逐漸增大，一部分酶分子沒有機會和底物接觸，致使水解液DE值基本不再變化。考慮到成本因素，選取2.00%為較優的α-淀粉酶添加量。

2.2.2 pH值對液化液DE值的影響

圖 2 pH值對液化液DE值的影響Fig.2 Effect of pH on DE of liquefaction

由圖2可知，水解液DE值隨著pH值的增大先升高后降低，pH值在7左右，即薏米糊化后在自然狀態下液化時DE值最大，達到18.72%。因為pH值會影響酶分子構象的穩定性和極性基團的解離狀態，從而影響酶分子的構象以及酶與底物的結合力和催化能力[20]。α-淀粉酶最適作用pH值為6.0～7.0，在這個pH值范圍內，α-淀粉酶才能很好的發揮作用。水解液過酸或過堿都會影響其穩定性，導致酶活性降低甚至失去活性。因此，較優的液化pH值為7.0左右。

2.2.3 液化溫度對液化液DE值的影響

圖 3 液化溫度對液化液DE值的影響Fig.3 Effect of temperature on DE of liquefaction

由圖3可知，水解液DE值隨著溫度的升高先增大后降低，溫度為65℃時DE值最大，達到17.49%。液化溫度同時影響化學反應速率和酶的活性，當溫度小于65℃時，隨著溫度的升高，單位時間內酶分子與底物間的有效碰撞次數增加，液化反應速率加快；而當溫度超過65℃時，隨著溫度的繼續升高，α-淀粉酶變性失活，液化反應速率迅速下降。因此，液化的較優溫度在65℃左右。

2.2.4 液化時間對液化液DE值的影響

圖 4 液化時間對液化液DE值的影響Fig.4 Effect of liquefaction time on DE of liquefaction

由圖4可知，隨著液化時間的延長，水解液DE值逐漸增大，在3h之前增加很快，然后趨于穩定。淀粉的液化分兩個階段，開始時α-淀粉酶首先使直鏈淀粉快速降解，產生寡糖，使溶液黏度快速下降；然后作用于支鏈淀粉產生葡萄糖、麥芽糖和一系列α-限制糊精，同時使寡糖緩慢水解成葡萄糖和麥芽糖，從而使淀粉液化。后一階段反應速率比前一階段要慢得多，這可能是導致液化3h后DE值趨于穩定的主要原因。另外，隨著水解程度的加深，α-1,4-糖苷鍵減少，淀粉中存在的α-1,6-糖苷鍵影響了α-淀粉酶的水解速度，同時不斷積累的酶解產物也會抑制酶的活性，使水解逐漸變慢。為了節約時間以提高效率，確定液化時間為3h。

2.2.5 薏米淀粉液化的正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選取L9(34)正交表進行正交試驗，結果見表2。

表 2 薏米淀粉液化條件優化L9(34)正交試驗結果Table 2 Orthogonal tests of liquefaction of coixseed starch

表 3 薏米淀粉液化正交試驗結果方差分析Table 3 Analysis of variance for liquefaction of coixseed starch

由表2可知，各因素對液化液DE值都有影響，其影響主次順序為：溫度＞α-淀粉酶添加量＞pH值＞時間。由表3方差分析可知，α-淀粉酶添加量和溫度對液化效果有顯著影響；pH值和液化時間對液化效果影響不顯著。由此可得出最佳組合為A3B1C1D3，但此組并未出現在試驗組中，故進行了驗證實驗，得出該條件下水解液DE值為22.12%，低于試驗組中液化DE值最高的組合，故確定液化最優水平組合為A3B2C1D3，即α-淀粉酶用量2.0%、pH 6.5、溫度60℃、液化時間3.0h。

2.3 薏米淀粉糖化最佳工藝條件的確定

2.3.1 糖化時間對糖化液DE值的影響

圖 5 糖化時間對糖化液DE值的影響Fig.5 Effect of saccharification time on DE of saccharification

由圖5可知，2.5h之前糖化液DE值隨著糖化時間的延長逐漸升高，2.5h之后趨于平緩。這是因為糖化反應剛開始時，底物的濃度較高，反應速度受時間的影響較大；隨著反應的進行底物濃度逐漸降低，反應速率也隨之降低，2.5h后DE值無顯著變化(P＞0.05)。綜合考慮糖化效果和生產效率，選取2.5h為較優糖化時間。

2.3.2 糖化酶添加量對糖化液DE值的影響

圖 6 糖化酶添加量對糖化液DE值的影響Fig.6 Effect of glucoamylase amount on DE of saccharification

由圖6可知，加酶量小于1.5%，水解速度隨酶用量的增加而升高；加酶量大于1.5%時，糖化DE值變化不大(P＞0.05)。考慮到成本因素，選取1.5%為較優的糖化酶添加量。

2.3.3 糖化溫度對糖化液DE值的影響

圖 7 糖化溫度對糖化液DE值的影響Fig.7 Effect of temperature on DE of saccharification

由圖7可知，水解液DE值隨著溫度的升高先升高后降低，溫度為65℃時達到最大值。這是因為糖化酶在室溫至65℃內起糖化作用；超過65℃糖化酶失活嚴重。因此，較優的糖化溫度為65℃。

2.3.4 pH值對糖化液DE值的影響

圖 8 pH值對糖化液DE值的影響Fig.8 Effect of pH on DE of saccharification

由圖8可知，隨著pH值的增大，水解液DE值先升高后降低，pH值為5時DE值達到最大73.3%，隨后迅速下降。原因是糖化酶的最適作用pH值為4.0～4.5，pH值過大或過小都會導致酶蛋白變性，從而影響酶分子與底物分子的結合和催化，最終影響水解速率。因此，確定糖化pH值為5.0。

2.3.5 薏米淀粉糖化的正交試驗優化

在單因素試驗的基礎上，選取L9(34)正交表進行正交試驗，結果見表4。

表 4 薏米淀粉糖化條件優化L9(34)正交試驗與結果Table 4 Orthogonal tests of saccharification of coixseed starch

表 5 薏米淀粉糖化正交試驗結果方差分析Table 5 Analysis of variance for saccharification of coixseed starch

由表4可知，各因素對糖化DE值影響主次順序為：時間＞糖化酶加酶量＞溫度＞pH值。由表5方差分析可知，時間對糖化效果有極顯著影響，而糖化酶的添加量對糖化效果有顯著影響。由此可得出最佳組合為A2B3C3D3，但此組并未出現在試驗組中，故進行了驗證實驗，得出該條件下水解液DE值為75.7%，低于試驗組中糖化DE值最高的組合，故確定糖化最優水平組合為A2B3C1D2，即糖化時間2.5h、糖化酶添加量2.5%、溫度55℃、pH4.5。在此最優水平組合下得到的最終水解液中還原糖含量和DE值分別為6.87g/100mL和76.4%。

3 結 論

本實驗對薏米酒精發酵之前的液化和糖化工藝進行了研究，確定最佳液化工藝條件為：α-淀粉酶添加量2.0%、pH6.5、液化溫度60℃、液化時間3.0h，此時液化液的DE值為22.55%，過濾后水解液澄清透明，色澤淺黃，不黏稠。在此條件下液化后的料液，再加入糖化酶進行糖化的最佳工藝參數為：糖化時間2.5h、糖化酶加酶量2.5%、糖化溫度55℃、pH4.5，最終水解液中還原糖含量和DE值分別為6.87g/100mL和76.4%。為后續薏米酒精發酵的研究提供數據基礎。

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