6個中藥單體對結腸腺癌細胞SW620體外增殖活性的影響

張敏，葉春，曹錄秀，盛艷梅

（成都醫學院藥學院，成都 610083）

結腸癌（colon cancer，CC）指發生在盲腸、升結腸、橫結腸、降結腸、乙狀結腸的惡性癌瘤。近年來，隨著生活水平的提高、生活習慣的改變，結腸癌在我國的發病率呈不斷上升趨勢，在消化道腫瘤中已僅次于胃癌，位居第2。苦參、三七、大黃是中醫臨床用于治療CC的經驗方中的三味常用中藥，據文獻［1－3］報道，三味藥材中的化學成分具有一定的抗腫瘤活性。

為進一步研究其對結腸癌的作用及物質基礎，以篩選抗癌療效確切的組分配伍新方，本文擬對三味中藥中多個單體成分的體外抗癌活性進行對比研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 結腸腺癌細胞株SW620（購于中國科學院細胞庫）。

1.1.2 藥品與試劑 苦參堿（XC071201）、氧化苦參堿（XC071212）購自西安小草生物技術有限公司，大黃 素 （MUST－11042601）、蘆 薈 大 黃 素 （MUST－10112301）、人參皂苷Rh2（MUST－09071501）、人參皂苷Rg1（MUST－11041201）購自成都曼思特生物科技有限公司。DMEM高糖培養基（Hyclon公司）、胰蛋白酶（GIBCO公司），MTT、DMSO（均購自Sigma公司），胎牛血清（PAA），其余為國產分析純。

1.1.3 主要儀器 倒置相差顯微鏡（Olympus IX70，Japan）、CO2孵箱（Thermo 3111）、超凈工作臺（SW－CJ－2FD，蘇 州 凈 化 公 司，中 國 ）、超 純 水 儀（Millipore）、酶標儀（Multiskan MK3）等。

1.2 方法

1.2.1 藥物配制 稱取適量苦參堿、氧化苦參堿、大黃素、蘆薈大黃素、人參皂苷Rh2、人參皂苷Rg1，均用無血清培養基溶解成相應濃度，過濾除菌備用。

1.2.2 細胞接種培養［1］取對數生長期細胞，消化后吸管吹打使之分散均勻制成單細胞懸液，按1×105個／mL細胞，100μL／孔接種于96孔培養板中，分別加入相同體積的各不同濃度受試藥液，同時加入適量完全培養液（900mL／L DMEM培養基，100 mL／L胎牛血清，青霉素1×105U／L，鏈霉素1×105U／L）補足，終體積為200μL／孔（每組6個復孔），同時設空白對照組，繼續培養24、48h。

1.2.3 MTT 微量比色法檢測［4］培養結束前加入MTT液50μL／孔繼續培養4h，吸棄上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）150μL／孔，充分振蕩，室溫靜置10min，用酶標儀于492nm波長處測定吸收值A，并計算細胞增殖抑制率 （%）＝ （1－藥物組A值／對照組A值）×100%。期間每天于倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行數據處理，數據資料以均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析（ONE WAY ANOVA），P＜0.05為差異具有統計學意義。?

圖1 對照組細胞培養24h（×200）圖2給藥組細胞培養24h（×200）圖3 對照組細胞培養48h（×200）圖4 給藥組細胞培養48h（×200）圖5 對照組MTT染色（×200）圖6 給藥組MTT染色（×200）

2 結果

2.1 形態學觀察

顯微鏡下可見細胞培養約2h開始貼壁，貼壁后的細胞基本呈圓形。12～24h細胞開始伸出長短不等的細小突起，細胞多呈梭形。48h后正常組梭形細胞數明顯增加，給藥組細胞生長狀態變差，且細胞數目未見明顯增加。MTT作用4h后，可見給藥組細胞形成結晶數較正常對照組明顯減少（見圖1～6）。

2.2 各成分對細胞體外增殖活性的影響

MTT微量比色法檢測得到5個不同濃度的6個成分分別作用24、48h后的吸收值A（其大小能反映活細胞數量），并按公式計算細胞增殖抑制率。

作用24、48h后，苦參堿、氧化苦參堿各濃度均能明顯抑制體外培養的SW620結腸癌細胞增殖，且呈明顯的劑量和時間依賴性（見圖7）。

作用24、48h后，人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg1各濃度均能顯著抑制體外培養的SW620結腸癌細胞增殖，其中人參皂苷Rh2隨濃度增加，對癌細胞增殖的抑制率亦增強，呈劑量和時間依賴性（見圖8）。

作用24、48h后，大黃素、蘆薈大黃素較高濃度均能顯著抑制SW620結腸癌細胞的增殖，呈明顯的劑量和時間依賴性（見圖9）。

圖8 人參皂苷Rh2、Rg1對細胞的增殖抑制率

圖9 大黃素和蘆薈大黃素對細胞增殖活性的影響

3 討論

中醫認為CC的病因病機，局部屬“毒、瘀”，整體為“虛”，以毒邪蘊結結腸為中心，痰濕瘀血互積助長其形，臟腑氣血耗傷為本。根據對CC“毒、瘀、虛”病因病機的認識，中醫采用扶正固本、清熱解毒、清熱燥濕、活血化瘀等治法，選擇中藥組成復方。苦參、三七、大黃為郭子光教授主編《現代中醫治療學》中所載灌腸治療CC經驗方中的主藥，苦參清除蘊結結腸之濕熱毒邪，三七去除結腸局部瘀血而止血，又兼扶正之效，大黃能疏導結腸之濕熱、食毒等毒邪。三藥合用，主要針對CC患者癌變局部“毒、瘀”的基本病機，可起祛除蘊結結腸之諸毒邪、瘀滯，緩解便膿血、腸梗阻、腹痛、腹瀉等并發癥，提高患者生存質量。

該方三味中藥中苦參堿、氧化苦參堿、蘆薈大黃素、人參皂苷 Rh2等成分已有文獻［2，3，5］報道其抗癌活性及作用機制。本文為進一步研究其對結腸癌的作用及物質基礎，對這些成分進行了抗癌活性對比研究。結果表明，單體苦參堿、氧化苦參堿、大黃素、蘆薈大黃素、人參皂苷Rh2、Rg1在不同濃度下均表現出一定的抑制SW620結腸癌細胞體外增殖的作用，其中尤以蘆薈大黃素最顯著，且表現出良好的量效和時效關系。課題組將選取活性較強的單體成分組成配伍復方進行抗癌活性研究，以期得到療效確切的抗結腸癌新復方。

［1］梁磊，張緒慧，王曉燕，等.槐定堿對人結腸腺癌細胞株SW620增殖 和 凋 亡 的 影 響 ［J］.中 國 藥 理 學 通 報，2008，24（6）：782－787.

［2］鄒健，冉志華，許琦，等.氧化苦參堿對人結腸癌細胞株SW1116殺傷作用的實驗研究［J］.中華消化雜志，2005，25（4）：207－211.

［3］代群，劉培.人參皂苷 Rh2對人結腸癌細胞株SW620和LOVO生長的抑制作用［J］.浙江中西醫結合雜志，2010，20（008）：466－467.

［4］盛艷梅，謝興亮，韓麗，等.3個廠家來源黃芪皂苷提取物對淋巴細胞增殖的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17（2）：98－100.

［5］梁磊，王曉燕，張緒慧，等.苦豆子生物堿抗結腸腺癌細胞株SW620的作用篩選［J］.中藥材，2008，31（6）：866－869.