老年患者白假絲酵母菌基因分型與藥敏試驗分析

吉地阿依，丁顯平

（1.四川大學生命科學學院生物資源與生態環境教育部重點實驗室遺傳醫學研究所，成都 610064；2.四川省第五人民醫院，四川省老年病研究所，成都 610041）

真菌在自然界中分布廣泛，常以寄居和腐生方式生活，屬于條件致病菌。近年來由于濫用廣譜抗生素、大量使用免疫抑制劑以及廣泛運用侵入性技術等原因導致臨床標本中酵母樣真菌的分離率顯著增加［1］。白假絲酵母菌是醫院內感染的重要病原菌，占臨床真菌感染的70%～90%［2，3］，且感染致死率高達40%［4］。本研究收集從臨床標本中分離并鑒定的320株白假絲酵母菌，用PCR方法擴增其25SrDNA基因的內含子區，根據可轉座I型內含子插入片段的數目及大小對白假絲酵母菌進行分型，并對不同基因型白假絲酵母的耐藥性進行分析。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 2009年1月～2012年1月四川省第五人民醫院（四川省老年病醫院）臨床微生物實驗室分離的320株白假絲酵母菌，分別來源于男性201例，女性119例，平均年齡≥65歲。菌株主要來自痰標本（88.13%），其余為咽拭子、大便、血液、尿液、傷口分泌物、穿刺液等標本。所有自假絲酵母菌均經革蘭氏染色鏡檢確認，用VITEK 2－Compact全自動微生物分析系統YST鑒定卡進行鑒定。標準菌株：白假絲酵母菌ATCC 90028。

1.1.2 主要試劑 法國生物梅里埃YST酵母菌鑒定卡、法國生物梅里埃ATB Fungus 3真菌藥敏試條、上海生物工程技術服務有限公司合成的引物［序列為：INT－L（5′－ATAAGGGAAGTCGGCAAAAT AGATCCGTAA－3′）和 INT－R（5′－CCTTGGCTG TGGTTTCGCTAGATAGTAGAT－3′）］、瓷珠保存管、Taq DNA 聚 合 酶、dNTPs、MgCl2、及 DNA Ladder Marker。

1.1.3 主要儀器設備 VITEK 2－Compact全自動微生物分析系統、PCR基因擴增儀和電泳儀。

1.2 方法

1.2.1 白假絲酵母菌的鑒定 臨床送檢的培養標本經過培養后生長出的疑似酵母樣真菌菌落，經革蘭氏染色鏡檢確認為革蘭陽性酵母樣真菌，用法國生物梅里埃VITEK 2－Compact全自動微生物分析儀所配套的YST酵母菌鑒定卡進行鑒定，確認為白假絲酵母菌。

1.2.2 白假絲酵母菌的保存 用接種環挑取幾顆經18～24h培養后得到的白假絲酵母菌菌落（接種于瓷珠保存管的凍存液中），擰緊瓶蓋，來回顛倒混勻，使細菌得以乳化，配成的菌懸液濁度要求為3～4個麥氏比濁單位；用無菌移液器盡可能吸出凍存管中的菌懸液，將瓷珠存放于－20℃的冰箱中備用。1.2.3 白假絲酵母菌的DNA制備 從瓷珠保存管中取出瓷珠，將白假絲酵母菌菌株直接接種于酵母浸出粉－胰蛋白胨－右旋葡萄糖（YEPD）平板上，在35℃孵育箱中培養24～48h，待生長出單個的純菌落。取1個純菌落加入到500μL的原生質體緩沖液中，原生質體緩沖液成分為1mmol／L山梨醇、0.25mg溶菌酶、1%β－巰基乙醇、0.25mg溶酵母菌酶，充分振蕩混勻后放入35℃水浴箱中反應2h，50 000r／min離心5min，取沉淀加入0.5mL裂解液，65℃水浴1h，按酚／氯仿／異戊醇法抽提出白假絲酵母菌的DNA備用。

1.2.4 PCR擴增 M為DL2000分子量標準，9為A型白假絲酵母菌標準菌株ATCC90028，1～8為實驗白假絲酵母菌PCR擴增所用特異性的引物，是針對白假絲酵母菌25SrDNA編碼區可轉座I型內含子而設計，反應總體積為30μL的反應體系中包含 PCR 緩 沖 液、INT－L、INT－R、Taq DNA 酶、dNTPs和 Mgcl2。反應過程為：預變性94℃5 min，變性94℃1min，退火56℃1min，延伸72℃2min，重復30個循環后，重復延伸72℃7min。反應結束后，所有的PCR擴增產物放于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳。根據PCR擴增產物的大小和條帶數目確定基因型，一條450bp帶為A型，一條840bp帶為B型，一條450bp帶加一條840bp帶為C型。

圖1 部分白假絲酵母菌基因分型結果

1.2.5 白假絲酵母菌的藥物敏感性分析 采用法國梅里埃公司的ATB Fungus 3真菌藥敏試劑盒，按板條操作說明進行，根據美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）頒布的 M27－A準則進行結果判定。實驗同時用白假絲酵母菌ATCC 90028做質控。抗真菌藥物包括兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑和5－氟胞嘧啶。

2 結果

2.1 320株白假絲酵母菌的分布

從臨床標本中分離出320株白假絲酵母菌，分別為痰標本282株（88.13%），咽拭子11株（3.44%），尿8株（2.50%），便15株（4.69%），分泌物3株（0.94%），穿刺液1株（0.31%）。

2.2 320株白假絲酵母菌的基因分型

根據電泳圖譜（見圖1），320株白假絲酵母菌分為3種基因型，包括A型201株（62.81%），B型95株（29.69%），C型24株（7.5%），未分離到D型和E型。

2.3 不同基因型白假絲酵母菌的藥敏試驗結果分析

白假絲酵母菌A、B、C 3種基因型對主要抗真菌藥物的藥敏結果分析（見表1）。本實驗顯示白假絲酵母菌A型對5－氟胞嘧啶耐藥率高于B型和C型；C型對兩性霉素全都敏感，敏感率高于A型和B型；C型對氟康唑、伊曲康唑的耐藥率高于A型和B型；B型對伏立康唑耐藥率高于A型和C型。

3 討論

伴隨臨床廣譜抗生素和抗真菌藥物的大量使用，真菌已成為醫院感染的重要病原菌之一。由于傳統的分型方法所能鑒定的真菌種類有限，且無法進行種類的分型鑒定，嚴重影響對真菌感染的及時診斷和早期治療。因此，尋求其他方法從分子水平進行種間及種內的分型是真菌臨床研究及治療急需解決的關鍵問題。如何能夠及時、準確地診斷真菌病是降低患者病死率的關鍵所在。利用分子生物學的方法開展深部真菌病診斷和分型研究，對指導臨床正確、有效地用藥有極為重要的意義。常用的白假絲酵母菌的基因分型方法主要有脈沖電泳核型－PFGE、限制性片段長度多態－RFLP、隨機擴增多態性DNA－RAPD、擴增片段長度多態性－AFLP、DNA指紋、核酸序列測定及微衛星多態性和基因芯片等。

表1 A、B、C型白假絲酵母菌藥敏結果（%）

真菌的線粒體有自己獨立的DNA和核糖體。核糖體又稱為核蛋白體，是蛋白質合成的場所，核糖體內包含有RNA和蛋白質，真菌細胞中有兩種核糖體，分別是細胞質核糖體和線粒體核糖體。細胞質核糖體常呈游離狀態，其中的RNA根據沉降系數的不同可分為：25SRNA、18SRNA、5SRNA分子等。

白假絲酵母菌在25SrDNA編碼區內存在一個可轉座I型內含子，其中的3個插入片段分別為252 bp、341bp、379bp，形成的可轉座I型內含子分為：379bp（插入379bp）、621bp（插入379bp和252 bp）、962bp（插入379bp、252bp和341bp）。有研究［5，6］報道，白假絲酵母菌基因組內高度保守的25S rDNA基因序列，可設計成特異的引物，用聚合酶鏈式反應進行真菌特異性的擴增，通過觀察電泳圖譜上的條帶即可將白假絲酵母菌分成5種基因型：A型（一條450bp帶）、B型（一條840bp帶）、C型（一條450bp帶加一條840bp帶）、D型（一條1 080bp帶）、E型（一條1 400bp帶）。本研究采用PCR方法擴增白假絲酵母菌的25SrDNA基因的內含子區進行基因分型。臨床分離的320株白假絲酵母菌被分成A型180株，B型95株，C型45株，未分離到D和E型，結果與She等［7］一致。

本實驗所用320株白假絲酵母菌全部分離自四川省老年病醫院入院的慢性阻塞性肺炎患者，菌株主要來源于痰標本，占到了88.13%。患者平均年齡＞65歲，常伴有一種或多種基礎疾病，且大多在白假絲酵母菌感染之前都使用過抗生素或有過侵入性操作。COPD患者長期大劑量接受抗生素治療，使自身正常菌群受到破壞，呼吸道防御功能的減弱以及臨床侵襲性的操作等都給真菌的入侵創造了好的條件。COPD伴真菌感染臨床病死率相對普通的COPD患者較高，主要通過病史、臨床癥狀、影像學檢查以及實驗室檢查等進行。通過藥敏實驗發現：沒有內含子的A型對5－氟胞嘧啶耐藥率高于含有內含子的B型和C型，這或許與25SrDNA中I型內含子的存在會降低白假絲酵母菌對5－FC的耐藥性有關；C型未出現對兩性霉素耐藥菌株，敏感率高于A型和B型；C型對氟康唑、伊曲康唑的耐藥率高于A型和B型；B型對伏立康唑耐藥率高于A型和C型。

白假絲酵母菌是人類最重要的條件致病性真菌，用PCR分型的方法對其分型，快速、簡便、重復性好。了解不同基因型別的白假絲酵母菌耐藥情況，有助于發現易感菌株和易感基因，對研究真菌感染情況、指導臨床用藥有重要的指導意義，對白假絲酵母菌的流行病學研究有重要價值。

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