幽門螺桿菌雙基因多表位重組原核表達工程菌的構建及其表達特性的研究

楊靖，潘興，歐琴，周法庭，李建春，祝捷，周永君，李明遠，王保寧△

（1.四川大學華西基礎醫學與法醫學院微生物學教研室，成都 610041；2.四川萬可泰生物技術有限責任公司，成都 610041；3.湖北醫藥學院微生物學教研室，十堰 442000）

幽門螺桿菌（H.pylori）已被WHO定為第I類生物致癌因子，有大量研究［1，2］證實幽門螺桿菌感染與急慢性胃炎、胃十二指腸潰瘍、胃癌及胃粘膜相關淋巴瘤（MALT）等疾病密切相關。幽門螺桿菌感染多發生于發展中國家和第三世界，據胡伏蓮等［3］報道，我國20個省市幽門螺桿菌的感染率為42%～90%［3］。幽門螺桿菌感染會加重其他細菌和病毒腸道疾病［4］。目前臨床上常采用三聯或者四聯方法治療幽門螺桿菌感染，但治療方法復雜，存在病人依從性差和費用昂貴等問題，使幽門螺桿菌易產生耐藥性［5，6］，難以達到根治目的。減毒或滅活幽門螺桿菌疫苗雖成功誘導機體黏膜免疫，但易產生發熱、嘔吐、腹瀉等不良反應［7］，重組幽門螺桿菌疫苗由于具有免疫效果好、危險性低、免疫持久等優勢，顯示出良好的研究前景。

隨著對幽門螺桿菌發病機制的深入了解，已證實尿素酶、空泡毒素、粘附素和細胞毒性相關蛋白等對幽門螺桿菌的生長起重要作用［8］，其中尿素酶對于幽門螺桿菌的生存和侵襲尤為關鍵［9］。1990年Pallen等就提出以尿素酶作為抗原研制疫苗，隨后Tomb等對幽門螺桿菌基因進行測序，發現至少7個幽門螺桿菌基因參與編碼催化活性的尿素酶，其中ureA、ureB編碼一個分子量大小約為550kDa多聚脫輔基酶蛋白，ureE、ureF、ureG、ureH、ureI編碼鎳離子結合到多聚脫輔基酶蛋白有關的輔助蛋白［10］。尿素酶蛋白在幽門螺桿菌中含量豐富，占菌體可溶性蛋白含量的6%，常分布于細胞表面。

ureB與尿素酶活性相關，是幽門螺桿菌在胃抵抗胃酸，分解尿素產生氨云的關鍵基因，也是定植的關鍵基因之一。ureB蛋白能誘導機體產生保護性免疫，常被作為疫苗候選基因［11］。ureI為質子控尿素通道蛋白，該通道在中性pH時關閉，而pH為5.0時完全開放。尿素通過此通道進入胞漿，被尿素酶分解中和周圍H＋，即使胃內pH低于2.0，幽門螺桿菌周圍的pH也可保持在6.1左右，一般認為ureI是幽門螺桿菌在人胃內定植的必需基因［12］。ureI雖不參與尿酶的生物合成，但參與幽門螺桿菌H＋控尿素通道的過程，調控細胞內尿素酶的代謝，對幽門螺桿菌在人和動物體內生存起重要作用［13，14］。

本研究從ureI和ureB基因中篩選T細胞和B細胞優勢表位基因序列，串聯成600bp的含ureI和ureB雙基因的新序列，構建原核重組表達質粒和原核表達工程菌，研究工程菌的微生物學特性和表達重組蛋白（rIB）的免疫反應性，了解該重組蛋白與幽門螺桿菌悉尼株（H.Pylori SS1）抗原蛋白的相關性。

1 材料和方法

1.1 材料

原核表達重組質粒pET28a（＋）（卡那霉素抗性）購于 Novagen；BL21（DE3）為 Novagen產品。膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自Omega公司。Premix Taq酶、T4連接酶、限制性內切酶EcoR I、Xho I、DNA Marker均購自Takara公司。PVDF膜及HRP標記的羊抗雞IgG購自Earth公司。H.pylori SS1菌株、雞抗SS1特異抗體由四川萬可泰生物技術有限責任公司提供。

1.2 方法

1.2.1 幽門螺桿菌IB基因序列 依據GenBank中ureI和ureB DNA序列，經生物信息學分析，從ureI和ureB基因中篩選富含人T細胞和B細胞表位的核苷酸序列，串聯成含ureB和ureI基因的新幽門螺桿菌ureI－B基因。在線預測網站網址如下：www.imtech.res.in／raghava／propred，www.epipredict.de／index.html。根據 T、B細胞表位預測截取ureB和ureI的7個T、B細胞表位串聯做融合表達，預測無信號肽序列。全序列長558bp［15］，序列如下：ggattaacca aagtcgatcc taaaagcacc aaaaaaggtt tggattggcg tccgtattct tggtataaaa aaatgtatgg ccctaccaca ggcgataaag tgcgtttgaa aaaatctgca atcaatcatg cgttagacgt tgcggacaaa tacgatgtgc aagtcgctat ccacacagac actaaaaaaa gcattaaagaagatgtccag ttcgctgatt cacgtatccg ccctcaaacc attgcggctg aagacacttt gcatgacatg gggattttct caatcaccag ttctgactct caagcgatgg gtcgtgtggg tgaagttatc actcgtactt ggcaaacagc tgacaaaaac aaaaaagaat ttggccgctt gaaagaagaa aaaggcgata acgacaactt caaaaaaccg gttaaaaatt gccgtaacat cactaaaaaa gacatgcaat tcaatgacac taccgctcac attgaagtca atcctgaaac ttaccatgtg ttcgtggatg gcaaagaagt cacttctaaa ccagctaata aagtgagc設計合成片段：每個抗原片段中間加兩個賴氨酸KK。5＇段引入EcoR I酶切點，3＇端引入Xho I酶切點，由北京金維智生物技術公司合成。用DNAMAN 6.0軟件預測：MW＝21kD，PI＝9.8。1.2.2 IB原核表達工程菌構建和鑒定 參照分子克隆實驗，將IB基因克隆入原核表達載體pET28a（＋）中，再將pET28a（＋）／IB原核表達質粒轉化到大腸桿菌BL21（DE3）。篩選出含pET28a（＋）／IB質粒的大腸桿菌，轉入含卡那霉素的LB培養基中。培養過夜，次日收集約3mL上述菌液抽提質粒，EcoR I、XhoI雙酶切，1%瓊脂糖電泳觀察結果，并進行DNA測序確認。

1.2.3 IB原核表達質粒穩定性研究 用搖瓶模擬發酵過程，在非抗性培養基中傳代30代后，收集菌液，將菌液適當稀釋后，接種到不含卡那霉素抗性的LB培養皿，37℃培養過夜。挑取100個菌落，接種到含卡那霉素抗性的LB培養皿，37℃培養過夜，統計菌落數，計算質粒保有率PR＝K＋／K－，K＋ 指在含卡那霉素抗性培養基中生長的CFU／mL；K－指在不含卡那霉素抗性培養基中生長的CFU／mL［16］。1.2.4 工程菌誘導表達分析 將培養至對數生長期的大腸桿菌pET28a（＋）／IB按0.1%（V／V）的比例接種到LB培養基中，37℃培養3h左右，液體A600≈0.8時，加入1mmol／L的IPTG，22℃誘導4h后，4℃10 000r／min離心10min，分別收集沉淀和上清，沉淀經PBS洗滌后用超聲緩沖液重懸菌體，超聲破碎（200W、20min、28次，間隔20min），4℃、10 000r／min離心20min，分別收集裂解上清與沉淀。沉淀用包涵體鑒定液（100mm／L TriCl，50 mmol／L EDTA，50mmol／L NaCl，pH 8.0）處理后，10g／L的SDS凝膠電泳分析。

1.2.5 重組IB蛋白的純化和免疫反應分析 超聲破碎上清透析處理后，參照GE公司His Trap TM HP鎳純化柱說明書對表達的重組融合蛋白進行純化，用一步法親和純化目標蛋白，280mmol／L咪唑洗脫，0.01mol／L PBS透析；Lorry法測蛋白含量，SDS－PAGE和Gel－Pro Analyzer 4分析。純化蛋白SDS－PAGE電泳分離后，200mA恒流1h濕轉至PVDF膜 。含10mL／L牛血清的0.01mol／L PBS 4℃ 封閉過夜。用雞抗Hp ss1特異抗體IgY（1∶4 000），兔抗雞IgY的酶標抗體（特異兔IgG－HRP，1∶1000）分別做一抗和二抗，37℃反應1h，用PBST（含2mL／L Tween20的0.01mol／L PBS）洗滌3次，ECL試劑顯色。用不含目的基因的空質粒大腸桿菌工程菌BL21DE3的誘導物做對照，研究工程菌產物中重組蛋白的免疫反應原性。

2 結果

2.1 IB原核表達工程菌構建和鑒定

EcoR I／Xho I雙酶切后，在1.0%瓊脂糖電泳上出現一條約為600bp的片段，與預期結果一致（見圖1）。原核表達質粒pET28a（＋）／IB送金唯智公司測序，結果顯示插入基因序列正確，無突變，閱讀框架未發生改變。

2.2 IB原核表達工程菌穩定性

工程菌傳代30代，其質粒保有率均＞91%，說明重組工程菌中質粒穩定，丟失＜10%（見圖2）。

圖1 pET28a（＋）／IB中重組質粒酶切分析

圖2 pET28a（＋）／IB中重組質粒保有率

2.3 工程菌誘導表達情況

工程菌經IPTG誘導后在約28kD處出現一條蛋白條帶，與理論預測值相符（見圖3）。

2.4 重組IB蛋白的純化和免疫反應分析

經IPTG誘導，目標蛋白經His Trap TM HP一步法親和純化后，以抗H.pylori SS1為特異抗體，Western blot實驗結果也在28kD左右出現特異反應條帶，其分子量大小與理論值相符（見圖4）。

3 討論

利用原核表達系統可以使細菌細胞表達所需要的真核生物蛋白質，該系統包括原核表達質粒和表達宿主菌。本實驗選用的pET28a（＋）質粒是pET質粒中的一員，pET質粒是目前在大腸桿菌中克隆表達重組蛋白功能最強大的質粒。目的基因被克隆到pET質粒載體上后，受噬菌體T7強轉錄及翻譯信號控制，其表達由宿主細胞提供的T7RNA聚合酶誘導。T7RNA聚合酶誘導機制十分有效并具有選擇性：充分誘導時，幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白，誘導表達后幾小時，目的蛋白的量通常可占菌體總蛋白的50%以上。

3 pET28a（＋）／IB誘導前后SDS電泳

圖4 rIB蛋白純化前后的Western Blot實驗

宿主菌大腸桿菌Transetta（DE3）可補充大腸桿菌缺乏的6種稀有密碼子（AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA）對應的tRNA，提高外源基因在原核系統中的表達水平，而且Transetta（DE3）具有氯霉素（CamR）抗性，這就避免了轉化過程中可能帶來的操作污染。大腸桿菌Transetta（DE3）是噬菌體DE3的溶原菌，噬菌體DE3帶有lacI基因、lacUV5啟動子及T7RNA聚合酶基因。宿主菌形成溶原狀態后，在培養基中加入IPTG，受誘導的lacUV5啟動子可指導T7RNA聚合酶基因轉錄，開始生產T7RNA聚合酶，繼而質粒上的目的DNA開始轉錄。通過小培養優化IPTG的最佳誘導濃度和誘導時間以達到完全誘導，可以使目的蛋白達到最大量和最佳溶解性。

本研究成功構建原核表達質粒pET28a（＋）／IB，并在大腸桿菌Transetta（DE3）表達出His標簽的His－IB重組融合蛋白（rIB）。將目標序列測序結果遞交NCBI進行BLAST比對，結果與較為常見的標準菌株 H.pylori SS1、H.Pylori 26695、H.pylori J99和H.pylori G27菌株的UreB一致性分別為100%、97%、100%、99%，與這些菌株中ureI基因一致性均為100%。證實來源于幽門螺桿菌ureI和ureB基因的重組基因ureI－B屬于高保守序列。經對IPTG表達條件的優化，表達的rIB經純化后純度達90%，Western blot實驗結果證實可與抗H.pylori SS1特異抗體結合，說明其具有良好的免疫原性。

重組質粒pET28a（＋）／IB長期穩定表達是疫苗成功的關鍵之一。原核表達工程菌IB連續傳代30代未見質粒丟失，重組蛋白表達穩定，這為表達工程菌IB作為H.pylori的治療和預防性疫苗開發奠定了基礎。

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