臭氧參與NAD+/NADH氧化還原反應(yīng)機(jī)理的理論研究

田文欣

(陜西廣播電視大學(xué)，西安 710068)

1 NADH對生物分子的作用機(jī)理

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)及其還原形式(NADH)是一類重要的氧化還原輔酶。在生物體內(nèi)，NAD+和NADH在酶的催化下通過奪氫或給氫能將特定的物質(zhì)氧化或還原，為能量的存儲和釋放提供必要的準(zhǔn)備，是細(xì)胞能量代謝所必需的輔酶。生物體內(nèi)的許多氧化還原反應(yīng)和代謝過程都離不開它們的參與，其中，NAD+和NADH參與的多酶氧化還原體系是生物體細(xì)胞呼吸鏈中電子傳遞過程的主要生物氧化體系，糖、脂、蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)分解時的氧化反應(yīng)絕大部分也都是通過這一體系完成的，例如，糖酵解、三羧酸循環(huán)和線粒體呼吸鏈中的氧化還原反應(yīng)。

NADH的主要功能是實現(xiàn)電子傳遞。具有還原性的化合物如葡萄糖被氧化后會釋放能量，這些能量被轉(zhuǎn)移到 NAD+上，發(fā)生還原反應(yīng)成為NADH，該反應(yīng)是糖酵解和三羧酸循環(huán)的一部分。在真核生物中，NADH與NAD+之間的轉(zhuǎn)化是一個最重要的生物氧化還原反應(yīng)。例如，在線粒體中的電子轉(zhuǎn)移鏈中，NADH作為富能電子轉(zhuǎn)移輔酶參與ATP的合成。監(jiān)視NADH的氧化還原狀態(tài)是表征活體內(nèi)線粒體功能的最佳參數(shù)。NADH結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 NADH結(jié)構(gòu)

NADH的氧化和還原形式均被設(shè)置于反應(yīng)的連接作用中，可運(yùn)送電子從一個反應(yīng)到另一個反應(yīng)。因此，該輔酶在細(xì)胞中有2種形式:NAD+是一種氧化形式，它從其他分子上獲得電子而被還原為NADH;NADH又可被用來做還原劑提供電子。NADH的反應(yīng)活性中心是l，4－二氫吡啶環(huán)，它轉(zhuǎn)移形式上的負(fù)氫，將底物還原，而本身被氧化成吡啶鹽的形式。這些電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)是NADH的主要功能。NAD+/NADH氧化還原對擔(dān)當(dāng)整個反應(yīng)中氫化物2個電子和1個質(zhì)子的來源和受體。反應(yīng)過程見圖2。

圖2 NAD+/NADH氧化還原反應(yīng)

該反應(yīng)是可逆的，意味著輔酶可持續(xù)地在兩種形式之間循環(huán)而沒有消耗。

關(guān)于輔酶NADH上的負(fù)氫轉(zhuǎn)移究竟是通過什么歷程完成的，以及負(fù)氫將底物還原的機(jī)理，長久以來一直是學(xué)術(shù)界爭論的焦點問題。目前普遍被認(rèn)同的主要有2種機(jī)理:一步負(fù)氫轉(zhuǎn)移機(jī)理(極性機(jī)理)，反應(yīng)不經(jīng)過自由基中間體過程;以電子轉(zhuǎn)移為先行步驟的多步轉(zhuǎn)移機(jī)理(電子轉(zhuǎn)移機(jī)理)，它又可分為e－H轉(zhuǎn)移和(e－H+－e)轉(zhuǎn)移2種情況。

Jan Grodkowskl等［1］于1983 年研究了 NAD·/NADH對的單電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，指出在沒有酶參與的情況下，NAD+可能的電子轉(zhuǎn)移的2個步驟為:

其中第1步單電子還原反應(yīng)已通過脈沖射解作用被研究證實，在中性溶液中測得NAD+/NAD·對的氧化還原電勢E= －0.92 V。

由于輔酶NAD+及NADH在生物體內(nèi)所起到的重要作用，有關(guān)它們的研究己經(jīng)成為生物和化學(xué)及其他相關(guān)領(lǐng)域的重要課題。人們在關(guān)注NADH固有的循環(huán)代謝的同時，外來因素對NADH氧化還原反應(yīng)歷程的影響也引起了相關(guān)學(xué)者的研究興趣。

2003年Zielonka等［2］在NADH與二溴化物自由基(Br2·－)的氧化反應(yīng)中，觀測到NADH·+自由基陽離子和去質(zhì)子化形式(NAD·)的存在，說明該反應(yīng)包含電子轉(zhuǎn)移步驟:

2008年 Ekaterina等［3］指出:NADH 氧化還原反應(yīng)機(jī)理的建立取決于氧化劑，有機(jī)氧化劑比如醌類和一些四氮雜苯趨向于一步負(fù)氫轉(zhuǎn)移反應(yīng)路徑，而單電子無機(jī)氧化劑則趨向于連續(xù)的電子轉(zhuǎn)移路徑。

可以看到，反應(yīng)條件的改變和反應(yīng)物結(jié)構(gòu)的改變都有可能改變反應(yīng)機(jī)理。

2 臭氧對生物分子的作用機(jī)理

臭氧(O3)為光化學(xué)煙霧中的主要成份，約占90%左右，有強(qiáng)烈的刺激性和氧化性，是現(xiàn)代城市的重要環(huán)境污染物之一。O3除來源于交通廢氣外，還可由許多電器(如電視機(jī)、復(fù)印機(jī)、負(fù)離子發(fā)生器等)及衛(wèi)生消毒器材(如紫外線燈、O3消毒保鮮除臭系列產(chǎn)品)產(chǎn)生。

O3的毒性是由于其氧化性所致。被吸入機(jī)體后，O3可引起活性氧自由基的產(chǎn)生，與多數(shù)細(xì)胞組件反應(yīng)，包括蛋白質(zhì)、脂肪和DNA等大分子化合物，導(dǎo)致脂質(zhì)臭氧化作用，使不飽和脂肪酸氧化為脂肪酸的過氧化物，從而造成細(xì)胞損害。與此同時，臭氧在醫(yī)療衛(wèi)生方面卻有著積極的作用。一方面，臭氧可以對傷口進(jìn)行殺菌消毒，促進(jìn)細(xì)胞的新陳代謝;另一方面，臭氧也可以用于疾病的治療。

近年來，多家研究小組致力于研究臭氧對NADH的作用和影響。通過將小鼠暴露在一定濃度的臭氧環(huán)境下來檢測肺部細(xì)胞內(nèi) NAD+和NADH的濃度變化，進(jìn)而揭示臭氧對細(xì)胞代謝和生理過程更深入的影響，探究用于疾病治療時臭氧的作用機(jī)理。

臭氧作為一種強(qiáng)氧化劑，本身不是活躍的物種，不像分子氧可以呈現(xiàn)雙自由基.O－O.，臭氧可視為O=O－O結(jié)構(gòu)。

1994年William［4］對臭氧在肺部與目標(biāo)分子反應(yīng)形成自由基的機(jī)理進(jìn)行了分類研究，指出臭氧本身不是自由基，因它作用產(chǎn)生自由基具有兩種完全不同的機(jī)理:一個包含臭氧與烯烴的反應(yīng);另一個是與給電子體比如谷胱甘肽的反應(yīng)。

當(dāng)臭氧與水溶性給電子體作用時，可產(chǎn)生臭氧自由基陰離子，這個短暫的自由基陰離子迅速被質(zhì)子化，分裂成羥基自由基:

O3/對的還原電勢是1.6 V，因此臭氧與硫醇和苯鄰二酚類化合物，以及許多其他生物電子供體的電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)是熱力學(xué)可行的。

1999年Martin等［5］研究了一系列酚類的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)化合物與臭氧反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)其自由基形成的速率常數(shù)與這些自由基單電子還原反應(yīng)電勢呈線性關(guān)系，說明臭氧與這些化合物是通過電子傳遞而作用的，并提出一種可能的路徑(見圖3)。

圖3 臭氧與芳香族木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的初級反應(yīng)機(jī)理

臭氧與芳香族木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的反應(yīng)是一個完整的電子轉(zhuǎn)移過程，引發(fā)芳香族陽離子自由基和臭氧自由基的形成，質(zhì)子化作用后臭氧自由基分解得到氧氣和羥基自由基。

目前，通過實驗對臭氧和NADH直接作用的機(jī)理研究還沒有相關(guān)報道。由于實驗條件的限制，大部分研究只涉及到細(xì)胞中NADH對臭氧刺激的響應(yīng)，因此很有必要通過理論模擬手段揭示此反應(yīng)的作用機(jī)理。借助計算機(jī)技術(shù)、量子化學(xué)計算方法和各種動力學(xué)理論研究動力學(xué)反應(yīng)的機(jī)理及動力學(xué)性質(zhì)不但可對已有的實驗研究起到理論補(bǔ)充和證實，而且為進(jìn)一步的實驗研究提供理論依據(jù)。

3 采用理論化學(xué)方法研究臭氧參與NAD+/NADH氧化還原反應(yīng)的機(jī)理

為了方便研究和闡述輔酶NADH氧化還原反應(yīng)歷程，大量NADH的模型物被合成，以應(yīng)用于機(jī)理研究。本文選取甲基取代煙酰胺環(huán)上的腺苷二磷酸核糖的構(gòu)型來進(jìn)行機(jī)理分析。

基于文獻(xiàn)調(diào)研，在生物體內(nèi)存在NADH、NAD·、NAD+三種形式，臭氧參與NAD+/NADH氧化還原反應(yīng)的總反應(yīng)為

可能的機(jī)理為:

對于該反應(yīng)體系，主要對步驟(1)的質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)進(jìn)行直接動力學(xué)研究。采用密度泛函方法優(yōu)化各駐點的幾何結(jié)構(gòu)和頻率，在優(yōu)化好的構(gòu)型下計算能量，根據(jù)反應(yīng)物、中間體、產(chǎn)物的性質(zhì)尋找設(shè)計過渡態(tài)，將過渡態(tài)優(yōu)化并計算勢能，構(gòu)建勢能面，得到最佳反應(yīng)路徑。

在對NADH進(jìn)行構(gòu)型設(shè)計時，煙酰胺環(huán)上酰胺基上的氫與吡啶環(huán)上的活性氫分別呈順式和反式2種結(jié)構(gòu)(見圖4)。臭氧可能與NADH的2種構(gòu)型均發(fā)生反應(yīng)，所以要同時考慮順、反結(jié)構(gòu)上的作用情況，并對這2種情況下的反應(yīng)進(jìn)行比較。

圖4 NADH兩種幾何構(gòu)型

對于NAD·→ NAD+的電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，可以先對NADH、NAD· 、NAD+進(jìn)行NBO分析，由電荷分布情況為電子轉(zhuǎn)移提供參考依據(jù)。

4 結(jié)束語

臭氧參與NAD+/NADH氧化還原形式轉(zhuǎn)化的機(jī)理研究可為實驗提供更多的理論依據(jù)，彌補(bǔ)由于實驗限制而無法進(jìn)行的一些瞬態(tài)反應(yīng)，有助于從本質(zhì)上深入了解臭氧與生物分子相互作用產(chǎn)生自由基的機(jī)理和轉(zhuǎn)化規(guī)律。在理論方面關(guān)于臭氧與生物分子的反應(yīng)，目前大部分報道都是臭氧加成到不飽和鏈上或環(huán)上，對于參與生物分子氧化還原形式轉(zhuǎn)化的動力學(xué)機(jī)理還未見報道。因此，該項研究有助于擴(kuò)充生物反應(yīng)的理論數(shù)據(jù)，提升生物反應(yīng)動力學(xué)的研究水平。

［1］Jan Grodkowskl，Neta P，Brian W.Carlson，et al.One-E-lectron Transfer Reactions of the Couple NAD·/NADH［J］.The Journal of Physical Chemistry，1983，87(16):3135－3138.

［2］Jacek Zielonka，Andrzej Marcinek，Jan Adamus，et al.Direct Observation of NADH Radical Cation Generated in Reactions with One-Electron Oxidants［J］.The Journal of Physical Chemistry A，2003，107(46):9860 －9864.

［3］Ekaterina V，Bakhmutova-Albert，Dale W，et al.Chlorine Dioxide Oxidation of Dihydronicotinamide Adenine Dinucleotide(NADH)［J］.Inorganic Chemistry，2008，47(6):2205－2211.

［4］William A P.Mechanisms of Radical Formation From Reactions of Ozone With Target Molecules in the Lung［J］.Free Radical Biology ＆ Medicine，1994，17(5):451－465.

［5］Martin Ragnar，Tord Eriksson，Torbjorn Reitberger，et al.A New Mechanism in the Ozone Reaction with Lignin Like Structures［J］.Holzforschung，1999，53(4):423－428.