腦鈉尿肽基因rs198389單核苷酸多態性與冠心病的相關性研究

蕾茹，江小青，汪里萍，肖衛，劉黃軍

(荊州市第一人民醫院心內科，湖北荊州434000)

·論著·

腦鈉尿肽基因rs198389單核苷酸多態性與冠心病的相關性研究

蕾茹，江小青，汪里萍，肖衛，劉黃軍

(荊州市第一人民醫院心內科，湖北荊州434000)

目的探討腦鈉尿肽(BNP)基因rs198389位點單核苷酸多態性(SNP)與冠心病(CHD)的關系。方法取病例-對照方法，收集冠心病和健康者各961例，應用Real-time qPCR(TaqMan探針)技術進行基因分型，分析BNP基因rs198389位點SNP與CHD危險性的關系。結果CHD組和對照組比較，AA和GG基因型、A等位基因和G等位基因分布差異有統計學意義(P＜0.05)；GG基因型和G等位基因頻率在病例組(3.6%和16.7%)明顯高于對照組(2.1%和14.3%)。與A等位基因比較，G等位基因使CHD危險性顯著增加(OR=1.20，95%CI=1.01～1.43，P=0.04)。GG基因型者CHD危險性增加(P=0.04)，但在調整年齡、性別、吸煙、飲酒、體重指數、血甘油三脂、高血壓史、糖尿病史和CHD家族史等變量后結果差異無統計學意義(P=0.12)。結論BNP基因位點rs198389的G等位基因使CHD危險性顯著增加；BNP基因rs198389位點SNP可能與CHD易感性相關，但不是其獨立危險因素。

腦鈉尿肽；單核苷酸多態性；冠心病

冠心病(CHD)的發生與基因遺傳易感性有關。腦鈉尿肽(BNP)有維持機體循環系統和內環境穩定的作用，通過多種機制參與CHD的發生發展，BNP基因可能成為一種與CHD危險相關的候選基因。本研究對BNP基因的rs198389位點單核苷酸多態性(SNP)與CHD的關系進行初步探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料研究采用病例-對照設計。病例組和對照組各961例，為湖北地區無血緣關系的漢族人群。采用修訂后的Inter-heart調查表進行流行病學調查，所有研究對象均簽署了知情同意書。CHD診斷依據WHO診斷標準[1]或經冠脈造影顯示有一支或一支以上冠脈狹窄≥50%者(CHD組)。對照組為常規體檢健康者。心血管危險因素判斷：高血壓[收縮壓≥140 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和(或)舒張壓≥90 mmHg或目前正在服用降壓藥物]、糖尿病(空腹血糖≥7.0 mmol/L，餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L或目前在服用降糖藥物)、CHD家族史(父母中有CHD患者)、吸煙(平均每天至少吸1支，并且連續吸煙≥1年，包括現在吸煙或以前吸煙但已經戒煙達到一年以上者)、體重指數(體重指數=體重(kg)/身高(m)2，19～24為正常)。

1.2 方法

1.2.1 臨床參數檢測每位對象均于空腹12 h后抽取外周靜脈血，全自動生化分析儀測定總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、空腹血糖和肌酐。

1.2.2 基因擴增和分型抽取外周靜脈血6 ml，注入EDTA-K2抗凝離心管，搖勻。按PUREGENE DNA提取試劑盒說明書進行DNA抽提。測定和稀釋(GENTRA公司Puregene試劑盒)DNA至終濃度為5～10 ng/μl。基因分型采用Real-time qPCR技術，探針(TaqMan探針)、引物和基因分型試劑盒由ABI公司提供，按公司推薦的反應體系和條件在ABI-7900熒光定量PCR儀上進行PCR和終點讀板分析。Rs198389位點2條探針分別由FAM和VIC這2種熒光標記，上游引物序列5'-GTCTCCCGCTTCTTCCTTTCC-3'，下游引物序列5'-CAGGAAGAAAGCGCCAACCTA-3，探針序列為FAM-AAATGTCCGGGTGTCC-NFQ，VIC-CAAATGTCCAGGTGTCC-NFQ。A等位基因由VIC(綠色)熒光標記，G等位基因由FAM(紅色)熒光信號標記，兩個反應體系中均以ROX(黃色)熒光為參比。綠色曲線表示純合子AA基因型，紅色曲線表示純合子GG基因型，綠色和紅色雙曲線表示雜合子AG基因型。不同基因型的聚類分析：紅色表示AA基因型，蘭色表示GG基因型，綠色表示AG基因型。利用SDS 2.2.1軟件分析TaqMan基因分型結果。

1.3 統計學方法應用SPSS10.0軟件包統計分析。在本研究中所有計數資料用卡方檢驗；計量資料以均數±標準差(x-±s)表示，用獨立樣本t檢驗比較，首先進行方差齊性檢驗，以P＞0.05為方差齊性，進行t檢驗，方差不齊者采用非參數檢驗。采用非條件Logistic回歸模型判斷CHD危險因素作用的大小。混雜因素的控制采用多元逐步Logistic回歸模型分析，計算主要危險因素的調整OR和95%CI。以OR的95%CI不包含1為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組臨床資料比較CHD組男性693例，女性268例，平均年齡(59.73±10.13)歲；對照組男性673例，女性288例，平均年齡(59.73±9.78)歲，兩組間年齡和性別比較差異無統計學意義。CHD組中吸煙、空腹血糖、收縮壓水平、高血壓史、糖尿病史和CHD家族史顯著高于對照組，而飲酒史顯著低于對照組，見表1。兩組舒張壓[(81.67±14.33)mmHg和(82.20±11.00)mmHg]和體重指數[(24.31±3.58)和24.30±3.24)]比較差異無統計學意義(P＞0.05)?？偰懝檀妓綄φ战M明顯高于CHD組[(5.07±1.31)mmol/L和(4.48±1.02)mmol/L，P＜0.05]，甘油三酯在兩組間比較差異無統計學意義[(1.70±1.1)mmol/L和(1.70± 1.37)mmol/L，P＞0.05]，這可能與CHD組使用他汀類調脂藥治療干預有關。

2.2 兩組基因型和等位基因頻率分布經卡方檢驗，各基因型在總人群、CHD組和對照人群中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡規律(χ2值分別為1.16、1.57和0.00，P值分別為0.56、0.455和1.00)，說明本試驗人群的rs198389基因分布可反映整體人群的基因分布情況?？傃芯咳巳夯蚍植寂c美國國立生物技術信息中心(NCBI)公共數據庫提供的中國人群基因分布數據對比，差異無統計學意義(P＞0.05)。在CHD組和對照組之間，AA和GG基因型分布、A等位基因和G等位基因頻率差異有統計學意義，其中，GG基因型和G等位基因頻率在CHD組明顯高于對照組(P＜0.05)，見表2。

表1 CHD組和對照組心血管危險因素比較

表2 兩組rs198389基因型和等位基因分布[例(%)]

2.3 BNP基因rs198389多態性與CHD的關聯性采用非條件Logistic回歸分析。與A等位基因相比，G等位基因使CHD危險顯著增加(OR=1.20， 95%CI=1.01～1.43，P=0.04)。單因素分析時GG基因型者CHD危險顯著增加(OR=1.83，95%CI=1.05～3.20，P=0.04)。在調整年齡、性別、吸煙、飲酒、體重指數、血甘油三酯、高血壓史、糖尿病史及CHD家族史等變量后，GG基因型與CHD危險增加比較差異無統計學意義(OR=1.63，95%CI=0.89～3.00，P=0.12)，各值見表3。

表3 BNP rs198389基因多態性與CHD的相關性

2.4 多元逐步Logistic回歸模型分析結果CHD主要影響因素依次為高血壓史、糖尿病史、吸煙、CHD家族史、飲酒和性別，其中高血壓史、糖尿病史、吸煙、CHD家族史和性別(男性)使CHD危險顯著增加，而飲酒使其下降。基因型沒有被納入回歸模型最后步驟，提示BNP基因rs198389基因型可能不是CHD的獨立危險因素，見表4。

表4 CHD主要影響因素Logistic回歸模型

3 討論

腦鈉尿肽即B型利鈉肽屬于多肽類激素家族，可能通過抑制內皮細胞功能、抗纖維化、抑制心肌細胞及血管平滑肌細胞的增殖、介導脂解作用等參與CHD的發生、發展，其臨床應用價值越來越受到重視。

CHD是一種環境和遺傳因素共同作用而導致的常見疾病，近年來關于CHD遺傳易感性相關基因的研究成為熱點。人的BNP與ANP基因呈串聯排列，位于1號染色體上(1p36.2)，含有3個外顯子和2個內含子，編碼BNP激素原前體[2]。不同于ANP的分泌主要受激素分泌水平調控，BNP直接受到基因表達轉錄水平的調控[3]。因而，BNP基因多態性可能影響BNP基因表達活性或蛋白質功能。BNP基因rs198389位點位于基因5'端啟動子區，其SNP可能對基因啟動子活性產生直接影響，從而影響BNP基因表達，進一步作用于CHD的疾病過程。在蛋白質水平上，關于BNP與CHD的研究很多。PREVEND研究顯示，NT-proBNP水平與心血管事件發生率顯著相關，NT-proBNP水平每升高一倍使全因死亡率增加22%和心血管事件風險增加16%，認為NT-proBNP是死亡風險和心血管事件風險強有力的預測因子[4]。檢測BNP水平可用急性冠脈綜合征危險分層[5]。在基因水平上，BNP與CHD的研究國內外報道較少，近期有幾個關于BNP基因rs198389與疾病相關性的研究。冠狀動脈旁路移植術基因組試驗(The CABG Genomics Study)對7個相關基因139個SNPs進行分析發現，NPPA/NPPB基因7個位點SNPs與CABG術后心衰風險降低有關，其中包括rs198389位點，其次要等位基因與CABG術后心衰發生率降低顯著相關[6]。并且認為等位基因編碼的BNP質和量發生變化后，通過自分泌和旁分泌作用于心室肌，減輕術后心衰的發生[7]。Ellis等[8]發現NPPB基因位點rs198389的次要等位基因顯著升高血BNP和NT-proBNP水平，使舒張早期二尖瓣血流速度與二尖瓣環運動速度比值、左心室收縮末期容積指數和左心室舒張末期容積指數顯著減少，降低以心血管事件原因的再次住院率，認為BNP基因對心血管有保護作用。但也有臨床試驗發現基因多態性與疾病臨床情況無關聯，Costello-Boerrigter等[9]發現BNP基因rs198389多態性與心血管表型或生存率無顯著相關。研究結果的不同可能與試驗對象、方法和樣本量不同有關。

本研究發現BNP基因上5'端啟動子區rs198389位點多態性與CHD危險性相關。等位基因G顯著增加CHD危險，GG基因型在單因素分析時使CHD危險性顯著增加，提示該位點多態性可能成為CHD的一種遺傳易感性標志物。本研究還顯示在調整性別、年齡、吸煙、飲酒、體重指數、血甘油三脂、高血壓和糖尿病史、CHD家族史等混雜因素后，GG基因型與CHD危險的關聯性差異無統計學意義，這可能與CHD的遺傳機制呈多種微效基因積累作用模式有關，也可能是BNP基因rs198389位點在人群中突變率低(GG基因型為3.6%)影響了統計學意義。CHD病因學的復雜性決定了可能并不存在明顯的主效基因，因而單個微效基因多態性可能與CHD關聯不顯著。研究顯示不同基因多態性有協同作用[10]，因此，CHD的遺傳易感性研究需選擇多個候選基因，同時檢測多個基因多態性，綜合分析整體影響。

總之，鈉尿肽基因多態性分析進一步提高了對疾病分子學機制的理解，對研究CHD風險人群的篩查、個體化預防、診斷和治療具有重要的意義，但尚需符合遺傳學研究統計要求的大樣本及多基因多態性聯合研究及重復驗證。

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Association between single nucleotide polymorphism rs198389 in brain natriuretic peptide gene and coronary heart disease.

LEI Ru,JIANG Xiao-qing,WANG Li-ping,XIAO Wei,LIU Huang-jun.Department of Cardiology,the First People's Hospital of Jingzhou,Jingzhou 434000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the association between single nucleotide polymorphism rs198389 in-brain natriuretic peptide(BNP)gene and coronary heart disease(CHD).MethodsPatients with CHD(the CHD group,n=961)and 961 healthy subjects(n=961,the control group)were enrolled in this study.The BNP rs198389 polymorphism was genotyped by real-time quantitative polymerase chain reaction(Real-time qPCR).The association between BNP rs198389 polymorphism and CHD was analyzed by SPSS10.0 software.ResultsThere was statistically significant difference in the distribution ofAAand GG genotypes between the CHD group and the control group(P＜0.05).The frequencies of GG genotype and G allele were significantly higher in CHD group(3.6%and 16.7%)than in the control group(2.1%and 14.3%).G allele carries significantly higher risk of CHD thanA allele(P=0.04).GG genotype presented a significantly higher risk of CHD(P=0.04),but this risk was not more significant when adjusted for CHD risk factors by unconditional Logistic regression analysis(P=0.12).ConclusionThe G allele of BNP gene rs198389 site significantly increased the risk of CHD.The results suggest that BNP gene rs198389 may be a susceptibility gene of CHD,but it is not independent risk factor.

Brain natriuretic peptide;Single nucleotide polymorphism;Coronary heart disease

R541.4

A

1003—6350（2013）09—1258—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.09.0532

2012-12-13)

肖衛。E-mail：99xw@sina.com