高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方消渴降糖膠囊中槲皮素含量

季 波 ，夏愛(ài)軍 ，廖厚知

（1.中國(guó)人民解放軍廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥劑科，廣東 廣州 510010； 2.中國(guó)人民解放軍第303醫(yī)院藥劑科，廣西 南寧 530021； 3.廣西匯科藥物研究所，廣西 南寧 530007）

復(fù)方消渴降糖膠囊為在研中藥六類新藥，由番石榴葉、天花粉、生地、山藥、山茱萸、麥冬、五味子等7味藥組方，具有清熱生津、除煩止渴的作用，用于熱病津傷口渴，多飲、多尿、多食、消瘦、體倦無(wú)力、尿糖及血糖升高之消渴癥。番石榴葉為處方中君藥，為桃金娘科植物番石榴 Psidium guajavae L.的干燥葉[1]，具有生津止渴、甘平養(yǎng)胃、斂澀固陰的功效，主要有效成分為黃酮類、番石榴苷[2]、槲皮素、β－谷甾醇、無(wú)色矢車菊素、長(zhǎng)生苷、番石榴酸及揮發(fā)油丁香油酚等[3]，在中外民間均有廣泛使用，主要用于降血糖、調(diào)血脂、抗病毒、抗菌、抗氧化及收斂止血等方面[4]。現(xiàn)采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定槲皮素的含量，并對(duì)其測(cè)定方法進(jìn)行了研究[5－6]。

1 儀器與試藥

LC－2010A型高效液相色譜儀（日本島津）；SPD－M10Avp紫外檢測(cè)器（日本島津）；AB265－S型分析天平（；梅特勒－托利多）；UV－2450型分光光度計(jì)（日本島津）。槲皮素對(duì)照品（批號(hào)為10081－99050，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；甲醇為色譜純，鹽酸、磷酸均為分析純；復(fù)方消渴降糖膠囊（批號(hào)分別為20100601，20100602，20100603，20100801，20100802，20100803）及缺番石榴葉的陰性樣品(自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:VP － ODS C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相:甲醇 － 0.2% 磷酸溶液（50 ∶50）；流速:1.0 mL ／min，柱溫:室溫；檢測(cè)波長(zhǎng):360 nm。理論板數(shù)按槲皮素計(jì)不低于4000，此條件下槲皮素與其他成分分離度不低于1.5。

2.2 溶液制備

精密稱取槲皮素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含30 μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。取本品10粒，精密稱定，研勻，取0.5 g，精密稱定，置 100 mL 錐形瓶中，加甲醇 －2.5 mol／L 鹽酸溶液（4 ∶1）50 mL，水浴加熱回流 30 min，放冷，移至100 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，即得供試樣品溶液。取缺番石榴葉的陰性樣品0.5 g，精密稱定，按樣品溶液的制備方法制備，即得陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn):分別精密吸取2.2項(xiàng)下3種溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按確定的色譜條件測(cè)定，在此條件下樣品中槲皮素與其他組分達(dá)到基線分離，分離度大于1.5，理論板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算大于4000，保留時(shí)間約為13 min，陰性無(wú)干擾，見圖1。

線性關(guān)系考察:精密稱取槲皮素對(duì)照品10.12 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取 1，2，3，4，5 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件，分別進(jìn)樣 20 μL，測(cè)定，以峰面積積分值 Y對(duì)槲皮素進(jìn)樣量X（μg）進(jìn)行回歸分析，得回歸方程 Y＝2387389 X－4767，r＝0.9999。結(jié)果表明，槲皮素進(jìn)樣量在 0.2024 ～1.0120 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):取同一對(duì)照品溶液（30.36 μg ／mL），按上述色譜條件，依法操作測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定色譜峰面積，計(jì)算RSD值為0.92%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):精密吸取同一供試品（批號(hào)為20100601）溶液10 μL，在 2，4，6，8，24，48，72 h 時(shí)間隔進(jìn)行分析，測(cè)定色譜峰面積，計(jì)算 RSD值為0.89%，表明供試品溶液制備后72 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批號(hào)樣品6份（批號(hào)為20100601），依法制備供試品溶液并測(cè)定含量。結(jié)果平均含量為 2.581 mg／粒（5.140 mg／g），RSD 為 1.17% ，表明方法重復(fù)性好。

圖1 高效液相色譜圖

加樣回收試驗(yàn):取已知準(zhǔn)確含量（5.140 mg／g）的樣品 6份（批號(hào)為 20100601），每份取 0.25 g，精密稱定，置 100 mL 量瓶中，精密加入 1 mL槲皮素對(duì)照品溶液（1.254 mg／mL），揮去甲醇，按供試品溶液制備方法制備，分別注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件下測(cè)定槲皮素峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 槲皮素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.4 樣品含量測(cè)定

取復(fù)方消渴降糖膠囊6批，按上述方法測(cè)定，結(jié)果見表2。

3 討論

文獻(xiàn)[7－8]中曾采用含有鹽酸的甲醇溶液提取槲皮素測(cè)定含量。本試驗(yàn)在供試品溶液的制備時(shí)，參考了上述文獻(xiàn)，考察了甲醇－鹽酸超聲提取、甲醇－鹽酸回流提取，結(jié)果甲醇－鹽酸超聲提取水解不完全，甲醇－鹽酸回流提取、水解好、提取完全，可達(dá)到試驗(yàn)?zāi)康摹Ｔ诹鲃?dòng)相的選擇上，探討過(guò)甲醇－0.2%磷酸水溶液（60 ∶40）、甲醇 －0.2% 磷酸水溶液 （55 ∶45），結(jié)果分離度小于1.5未能達(dá)到要求；甲醇 －0.2%磷酸水溶液 （50∶50），分離度大于 1.5，出峰時(shí)間約為 13.5 min，達(dá)到了試驗(yàn)要求。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

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