大鼠馬錢子堿中毒肝細(xì)胞Bcl－2和Caspase－3蛋白表達的研究

湖北醫(yī)藥學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室 （十堰442000） 雷懷成 朱方成 魏 來

馬錢子主要藥理作用是散結(jié)消腫、通絡(luò)止痛，臨床用以治療風(fēng)濕類疾病、中風(fēng)偏癱、癡呆、視網(wǎng)膜病變以及骨傷科、腫瘤等疾病。馬錢子堿能抑制肝癌細(xì)胞生長，可能通過肝癌細(xì)胞FAS基因和蛋白表達增加，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑制作用［1～3］。有研究表明，馬錢子中毒后藥物濃度在肝、腎最高。本實驗采用免疫組化方法對大鼠馬錢子堿中毒后的肝臟Bcl－2和Caspase－3蛋白表達進行檢測，分析肝細(xì)胞Bcl－2和Caspase－3蛋白表達的變化規(guī)律，為毒理學(xué)、法醫(yī)毒理病理學(xué)研究提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

材料與方法

1 材 料

1．1 動物：Wistar大鼠60只（湖北醫(yī)藥學(xué)院實驗動物中心提供），雌、雄各30只，體質(zhì)量為（200±10）g。大鼠喂養(yǎng)1周后，隨機分為對照組（20只）和染毒組（40只）。采用將馬錢子堿粉劑溶解于有機溶劑后，用蒸餾水稀釋，按文獻［2］分別給予馬錢子堿233、300 mg∕kg一次性灌胃給藥。染毒組動物分低、中劑量（233、300 mg∕kg）兩組，每組20只；對照組用等量無離子水灌胃，正常飲食。

1．2 主要試劑：兔抗鼠Bcl－2和Caspase－3多克隆抗體由北京中杉生物技術(shù)有限公司提供；馬錢子堿由十堰市藥品檢定所提供。

2 方 法

2．1 給藥方案：染毒組分別在染毒后1、2、3、5、7 d時，頸椎脫位處死，每次處死8只。對照組分別在灌水后1、2、3、5、7 d處死，每次處死4只。取出肝臟，矢狀位切開，用10%的甲醛固定。

2．2 染色步驟：石蠟切片 相鄰切片1/2做常規(guī)HE染色，另1/2做免疫組織化學(xué)顯色。SP法：①石蠟切片脫蠟至水；②蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min；③3%H2O2室溫孵育5～10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；④5%～10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min。傾去血清，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或二抗工作液，37°C孵育1～2h；⑤滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗（1%BSA－PBS稀釋），37°C孵育10～30min；⑥ 滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根霉標(biāo)記卵蛋白，37°C孵育10～30min；⑦DAB顯色，蘇木精復(fù)染。

2．3 統(tǒng)計學(xué)方法 用Leica－Q500IW圖像分析儀，將每張免疫組織化學(xué)顯色呈陽性反應(yīng)的細(xì)胞切片在×200鏡下，隨機選擇10個視野，測量單位面積內(nèi)肝細(xì)胞呈陽性反應(yīng)的細(xì)胞數(shù)（/mm2），結(jié)果用SPSS 10．0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。

結(jié) 果

1 HE染色結(jié)果 光學(xué)顯微鏡下觀察可見肝淤血，部分肝細(xì)胞濁腫；對照組未見肝細(xì)胞病理變化。

2 免疫組織化學(xué)顯色結(jié)果

2．1 Bcl－2免疫組織化學(xué)顯色：對照組肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)見少數(shù)幾個Bcl－2陽性細(xì)胞表達（圖1）。染毒組胞漿質(zhì)胞核中均可見明顯棕黃色濃染；1 d組的肝細(xì)胞中，陽性細(xì)胞明顯增多（P＜0．05）。中毒2～3 d陽性細(xì)胞達到一定峰值（圖2、3），染毒5 d組陽性細(xì)胞逐漸減少（圖4），但至中毒后7 d，仍然可見少量的陽性細(xì)胞。Bcl－2蛋白陽性細(xì)胞數(shù)與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，見附表。

2．2 Caspse－3免疫組織化學(xué)顯色：對照組肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)未見Caspse－3陽性細(xì)胞表達（圖5）。染毒后1 d組肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色濃染（圖6），3、5 d組胞質(zhì)內(nèi)棕黃色染色最濃（圖7）。染毒組在不同時間段內(nèi)肝細(xì)胞中Caspse－3陽性細(xì)胞數(shù)與正常對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），并且都高于正常對照組。染毒后1 d陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，第2～3天后達到一定峰值，第5天、第7天陽性細(xì)胞呈下降趨勢。與對照組比較，染毒1、3、5和7d差異具均有統(tǒng)計學(xué)意義，見附表。

附表 各組染毒不同時間肝細(xì)胞中Bcl－2與Caspase－3蛋白表達陽性細(xì)胞數(shù)（，個/mm2）

附表 各組染毒不同時間肝細(xì)胞中Bcl－2與Caspase－3蛋白表達陽性細(xì)胞數(shù)（，個/mm2）

與對照組比較，＊P＜0．05

組 別1d Bcl－2 Caspase－3 2 d Bcl－2 Caspase－3 3 d Bcl－2 Caspase－3 5 d Bcl－2 Caspase－3 7 d Bcl－2 Caspase－3對照組 2．06±0．12 1．8±0．2 1．76±0．18 1．09±0．18 0．8±0．14 0．8±0．02 0．7±0．3 0．6±0．2 0．9±0．13 0．2±0．02低濃度組 121．0±10．8＊ 147±20．6＊ 165．8±21．6＊168．2±20．8＊ 189．5±19．7＊180．6±21．7＊ 125．3±16．7＊112．2±12．6＊ 98．0±6．1＊ 94．0±8．6＊高濃度組 118．0±15．6＊152．0±21．1＊ 172．4±22．4＊174．6±19．6＊ 188．2±18．5＊189．7±20．8＊ 129．6±17．4＊118．9±13．2＊ 93．6±8．2＊ 92．8±8．9＊

討 論

馬錢子為馬錢子科植物馬錢的干燥成熟種子［4］，其成份含生物堿2%～5%，主要為番木鱉堿約1．23%、馬錢子堿約1．55%［5］。馬錢子堿是馬錢子主要成分之一，是一種弱堿性生物堿，水溶性差，作為活血通絡(luò)和“以毒攻毒”代表藥物。胡錫琴等［3，6］研究發(fā)現(xiàn)馬錢子堿在人類肝細(xì)胞癌的細(xì)胞毒性效應(yīng)最強，能夠引起Hep G2細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡，Caspase－9蛋白酶解增加，Hep G2細(xì)胞線粒體膜去極化而殺滅肝癌細(xì)胞，它能引起Hep G2細(xì)胞的萎縮，阻礙細(xì)胞的形成，使DNA片段斷裂，細(xì)胞循環(huán)停止，最終導(dǎo)致Hep G2細(xì)胞凋亡。其機制可能與線粒體的去極化有關(guān)。首先馬錢子堿使細(xì)胞內(nèi)的Ca2＋快速、持續(xù)地增高，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的過程；其次，B淋巴細(xì)胞也參與了整個凋亡過程，而且它的過分表達會抑制Ca2＋濃度提高。B淋巴細(xì)胞和Ca2＋介導(dǎo)的線粒體途徑最終導(dǎo)致 Hep G2細(xì)胞凋亡［7，8］。Bcl－2家族蛋白編碼兩類功能相反的蛋白質(zhì)，其中Bcl－2和Bcl－xl抑制多種刺激因素引起的細(xì)胞凋亡，而Bax和Bak則促進細(xì)胞凋亡，甚至在某些情況下不依賴于外部刺激就足以引起細(xì)胞的死亡。Bax可通過其自身形成的Bax同二聚體和（或）與Bcl－2形成Bax－Bcl－2異二聚體發(fā)揮作用，Bax同二聚體促進細(xì)胞凋亡，Bax－Bcl－2異二聚體則抑制細(xì)胞凋亡［6，9～11］。本實驗表明，大鼠在馬錢子堿中毒后，肝細(xì)胞可表達Bcl－2，說明馬錢子堿中毒后可能對肝組織有損害。Bcl－2表達在中毒后1d～2d內(nèi)達高峰，隨后維持一段時間后逐漸降低，但即使在中毒7d后，其表達依然顯著高于正常。這說明Bcl－2的表達對肝細(xì)胞具有保護作用。

細(xì)胞色素C和ATP是激活細(xì)胞凋亡蛋白酶活化因子（Apaf－1）的輔助因子。活化的 Apaf－1、細(xì)胞色素C和Procaspase－9形成凋亡聚體，導(dǎo)致Caspse－3級聯(lián)效應(yīng)執(zhí)行凋亡過程。Caspase－3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，在各種原因?qū)е碌募?xì)胞凋亡過程中，Caspase－3的作用必不可少［12～14］。在治療各種疾病和抗腫瘤過程中，馬錢子堿在肝的濃度最高，可能會引起部分正常的肝細(xì)胞發(fā)生病理生理和形態(tài)學(xué)變化；本實驗研究結(jié)果顯示，大鼠在馬錢子堿中毒1 d后肝細(xì)胞中Caspase－3即出現(xiàn)陽性蛋白表達，在中毒2～3 d內(nèi)達高峰，維持一定峰值后逐漸降低，但在中毒7 d后，其表達依然高于正常對照組，而低、中濃度染毒組之間無差異。說明大鼠在馬錢子中毒后肝細(xì)胞可能存在少量的細(xì)胞凋亡。各種應(yīng)激源作用于機體后，通過不同的受體傳入細(xì)胞內(nèi)，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列生化改變，引起細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的激活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，這是一個復(fù)雜的生理和病理過程［14，15］。說明馬錢子堿中毒對肝細(xì)胞產(chǎn)生了損害，機體在有害因素作用下啟動一系列應(yīng)激反應(yīng)。中毒發(fā)生后，凋亡抑制基因啟動較快，保護細(xì)胞免于凋亡。本實驗顯示，促凋亡基因的表達雖然啟動較緩慢，但啟動后逐漸上升，并在較長時間保持較高水平的表達，持續(xù)時間較長［16，17］。

實驗中，中毒組大鼠的肝細(xì)胞Bcl－2和Caspase－3表達的時間均較長，說明馬錢子堿在肝內(nèi)代謝過程中，可能對部分肝細(xì)胞造成了損害。推測馬錢子堿可能致肝細(xì)胞線粒體發(fā)生形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，特別是線粒體膜電位及膜結(jié)構(gòu)改變，引起肝細(xì)胞有氧呼吸障礙，激發(fā)肝細(xì)胞的應(yīng)激狀態(tài)，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡發(fā)生。這一過程又激發(fā)了Caspase－3基因促進細(xì)胞凋亡。隨著馬錢子堿作用逐漸減弱，凋亡誘導(dǎo)因素逐漸減低，肝細(xì)胞凋亡終止。馬錢子堿中毒后的肝細(xì)胞出現(xiàn)Bcl－2和Caspase－3表達提示其參與了病理生理過程，但有待進一步研究、探討。

［1］王琦偉，劉 良，黃光照．馬錢子的毒理學(xué)研究進展［J］．法醫(yī)學(xué)雜志，2004，20（3）：183－184．

［2］秦建民，徐夏君，盛 霞，等．馬錢子堿抗肝細(xì)胞癌作用的實驗研究［J］．中華普通外科雜志，2011，26（3）：219－221．

［3］胡錫琴，郭翠華．馬錢子研究述要［J］．陜西中醫(yī)，2005，26（11）：1229－1230

［4］袁玉蘭．四制馬錢子及臨床應(yīng)用［J］．陜西中醫(yī)，2013，33（1）：102－103．

［5］李偉東，王素霞．馬錢子在痹證的配伍應(yīng)用［J］．陜西中醫(yī)，2003，24（12）：1124－1125．

［6］徐 睿，呂曉宇，蔡寶昌，等．馬錢子堿對人肝癌細(xì)胞Hep G2細(xì)胞膜電位和通透性的影響［J］．中草藥，2008，39（11）：1692－1696．

［7］Deng XK，Yin W，Cai BC，et al ．The apoptoticeff ect of Brucine from the seed of Strychnos nux－vomica on hum an hepatoma cells is mediated via Bcl－2 and Ca2＋involved mitochondrial pathway［J］．Taxicol Sci，2006，91（1）：59－69．

［8］張銀娥，楊惠芳，宋 輝．應(yīng)激與海馬神經(jīng)元凋亡［J］．工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病，2007，33（3）：180－181．

［9］Takemura G，F(xiàn)ujiwara H．Role of apoptosis in remodeling after myocardial infarction［J］．Phar macol Ther，2004，104（1）：1－16．

［10］朱旭陽，汪 楓，方維華，等．實驗性大鼠腦震蕩后Bcl－2的表達 ［J］．法醫(yī)學(xué)雜志，2007，23（1）：18－19．

［11］Vinet J，Bernier PJ，Andre’Parent．Bcl－2 expression in thalamus，brainstem，cerebellu m and visal cortexof adult pri mate［J］．Neuroscience Research，2002，42：269－277．

［12］Borner C．The Bcl－2 protein family：sensors and checkpoints for life－or－death decisions［J］．Molecular Immunology，2003，39（5）：615－647．

［13］常 青，王曉良．細(xì)胞色素C、線粒體與凋亡［J］．中國藥理學(xué)通報，2003，19（3）：241－144．

［14］Yun SJ，Lee DJ．Reduction but not cleavage of poly（ADP－ribose）polymerase during stress－mediated cell death in the rat hippocampus［J］．Neuroreport，2003，14（7）：935－939．

［15］Hishikawa K，Nakaki T，F(xiàn)ujii T．Connective tissue growth factor induces apoptosis via Caspase－3 in cultured human aortic smooth muscle cell［J］．Eur J Phar macol，2000，392（1）：19－22．

［15］Mclaughlin B，Hartnett KA，Erhardt JA，et al．Caspase 3 activation is essential for neuroprotection in preconditioning［J］．Pro Natl Acad Sci USA，2003，100（2）：715－720．

［16］王 曄，諶利華，陳偉杰，等．大鼠毒鼠強中毒內(nèi)臟器官Caspase－3與 Bcl－2蛋白的表達［J］．法醫(yī)學(xué)雜志，2006，22（4）：241－244．