Cyclin D1在急性白血病骨髓組織中的表達及臨床意義＊

陜西中醫學院第二附屬醫院血液科 （咸陽712000） 楊 艷 王越月 何春玲 田亞寧周智輝 張云志 閆昱江 張 楊 劉 芳 梁漫 董紅保 董昌虎

細胞周期素D1（Cyclin D1）是細胞周期G1期周期素家族最重要的成員，其表達失控將引起細胞增殖周期失調，而導致腫瘤發生；現已發現，多種組織來源的腫瘤均有Cyclin D1的過度表達，但有關急性白血病（AL）骨髓組織中該蛋白的研究很少；本實驗通過免疫組化染色方法，檢測Cyclin D1單克隆抗體在急性白血病及正常對照組骨髓組織中的表達，并結合急性白血病的臨床分型，探討Cyclin D1在急性白血病發生、發展及預后中的作用。

資料與方法

1 一般資料 本院2010年1月1日至2012年6月30日確診為急性白血病49例患者的骨髓組織標本，其中男27例，女22例，年齡16～76歲，中位年齡48歲；急性髓細胞白血病36例（其中3例由骨髓增生異常綜合征轉變而來、2例由慢性髓細胞白血病急變而來），急性淋巴細胞白血病13例；49例患者中29例為初診患者，13例為復發患者，7例完全緩解患者。正常對照組19例，來自陜西中醫學院第二附屬醫院病理科診斷的正常骨髓組織。

2 方法及步驟 取經冷丙酮固定、塑料包埋的存檔骨髓組織塊，制成2～3μm組織切片，裱片于用稀釋多聚－L－賴氨酸處理的載玻片上，吹干，用專用油筆圈定玻片上的待測組織區域，PBS液沖洗后滴加100μl Cyclin D1抗體（兔抗人單克隆抗體，福建邁新生物科技有限公司，批號：120510541B），室溫下孵育60 min后PBS液沖洗，加100μl酶標羊抗小鼠/兔Ig G聚合物，室溫下孵育15 min，PBS液沖洗后加100～200μl新鮮配制的DAB顯色液，室溫下孵育3～5 min，自來水沖洗，加蘇木素染色至細胞核淺藍色，PBS液沖洗返藍；酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，判斷結果。

3 判斷標準 Cyclin D1判斷標準：以細胞核呈彌漫的棕黃色顆粒為陽性細胞，在顯微鏡下觀測，選擇2個高倍視野，計數200個有核細胞中Cyclin D1著色的細胞比例數，求出平均值，根據陽性細胞所占的百分率分為以下五個等級：無陽性細胞者為陰性；1%～10%為（＋）；11%～20%（）；21%～30%（）；≥31%（）。

4統計學方法 采用SPSS17．0軟件包進行Mann－Whit ney Test秩和檢驗及χ2檢驗。P＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

1 Cyclin D1在急性白血病組及對照組骨髓組織中的表達 見表1。分組變量檢驗統計結果顯示：統計量U＝304．000，雙側漸近概率P＜0．05，故可認為急性白血病組與對照組的Cyclin D1表達差異有統計學意義。

表1 Cyclin D1在急性白血病組及對照組骨髓組織中的表達

2 Cyclin D1在初發未治、復發難治及完全緩解的AL的表達 見表2。復發難治患者（8/13）骨髓組織中Cyclin D1的表達高于初發未治患者（9/29），3組資料比較，差異有統計學意義（P＜0．05）。

表2 Cyclin D1在初發未治、復發難治及完全緩解的AL的表達

3 Cyclin D1在急性白血病骨髓組織中表達的特點 見附圖。急性白血病骨髓組織中用Cyclin D1抗體，經S－P染色后，可見骨髓內出現陽性細胞的表達在細胞核上。

附圖 急性白血病骨髓組織中Cyclin D1經S－P染色陽性細胞（×40）

討 論

在惡性腫瘤發生機理的研究中，越來越多的研究表明，細胞周期素（Cyclins）－細胞周期素依賴性激酶（CDKs）－細胞周期素依賴性激酶抑制蛋白（CKIs）系統作為細胞分裂、增殖的調控網絡，在腫瘤的發生學上起著極為重要的作用，Cyclin D1能夠激活細胞周期素依賴性激酶（CDKs），調控細胞的分裂和增殖，阻滯Cyclin D1的表達可阻斷細胞從G1期進入S期，而Cyclin D1的過度表達，可導致p RB蛋白的磷酸化修飾提前實現，加速細胞G1期到S期的轉變，促進細胞的增殖［1］；Cyclin D1是G1期周期素，其活化是腫瘤發生的重要原因之一［2］；近幾年的研究已經發現在子宮內膜癌、肺癌、乳腺癌、宮頸癌等多種腫瘤中都存在Cyclin D1基因結構和功能異常［3－8］；它在診斷、治療及預后評估上的應用價值也是目前腫瘤研究中的熱點之一，但有關Cyclin D1在骨髓組織中的表達卻鮮見報道。

白血病是血液系統最常見的惡性腫瘤，我們對急性白血病骨髓組織中Cyclin D1的表達研究發現，正常骨髓中未見Cyclin D1的表達，而急性白血病組骨髓組織中Cyclin D1的陽性率為34．69%，提示Cyclin D1的異常表達與血液系統最常見的惡性腫瘤—急性白血病的發生有一定的關系；有研究表明，幾乎所有的cyclins都可能作為一種原癌基因被激活后在腫瘤發生中起癌基因的作用［9］，吳玉新等［10］研究也表明細胞周期素D1與多種不同類型人類腫瘤的診斷和預后有關。

研究的49例急性白血病患者中，有32例患者未出現Cyclin D1的表達，而有17例患者均不同程度的出現Cyclin D1的表達，其中復發難治患者的陽性率高于初發未治患者，尤其是3例由骨髓增生異常綜合征轉變的急性髓細胞白血病患者中有2例Cyclin D1呈高表達（／），2例由慢性髓細胞白血病急變而來的急性髓細胞白血病患者Cyclin D1均呈高表達（／），7例完全緩解患者中Cyclin D1的表達均為陰性，其結果與李紅華等［11］所研究結果相似；對上述急性白血病患者化療1～2周期后緩解情況進行觀察顯示，Cyclin D1陰性表達患者的緩解率明顯高于其陽性表達患者，提示Cyclin D1的陽性程度與急性白血病的臨床病情及預后情況有一定關系，其高表達往往提示病情危重，預后較差。

在研究的49例急性白血病患者中，急性髓細胞白血病及急性淋巴細胞白血病中均有Cyclin D1的表達，但由于病例過少，差異無統計學意義，對二者是否存在差異還需進一步積累資料。

綜上所述，急性白血病骨髓組織中Cyclin D1表示屬無毒級，致癌、致畸及致突變實驗和細菌培養均為陰性［3］，成人急性毒性實驗結果為LD50＞13g/kg，屬實際無毒級；無致癌、致畸性；另外，它還能在體內分解、排泄，無毒性累積［4］。

使用醫用膠固定補片的另一個顧慮是其可降解性，因α－氰基丙烯酸酯聚合體在體內可以被代謝，完全排泄。但其在體腔內和組織內反應的實驗表明，化學性醫用膠用于人體和動物體內，根據用膠量，將于3～9個月才被逐漸降解吸收；而根據補片修補的原理，對于有足夠微孔大小的疝補片來說，成纖維細胞浸潤和膠原纖維蛋白的形成、且產生較穩定的瘢痕組織大約需要1個月時間，組織損傷修復的纖維增生期也在1個月內完成，而術后3個月植入補片與宿主組織的融合已相當牢固。因此，雖然化學性醫用膠在體內使用后3～9個月降解吸收，但已為維持補片的固定提供了充足時間。也有人認為該醫用膠28d后的強度比縫線低30%［5］，故并不能完全代替手術縫線，只是用于傷口的邊緣且要配合縫線一起使用［6］。

醫用膠在腹外疝術中使用注意事項。由于化學性醫用膠是一種粘合封閉劑，凝固快，會形成堅硬的膠合，封閉網孔，所以易造成感染或形成補片下的血腫與血清腫，所以我們的經驗是應該點狀應用于補片的粘合，而不能大面積涂抹封閉；手術創面使用醫用膠也應采用少量、薄層涂抹止血的方法。

在無張力疝修補術中應用一些新工藝、新材料，并借此來降低術后各種并發癥的發生和提高療效是疝外科發展的一大趨勢。我們在腹股溝疝Lichtenstein平片無張力修補術中應用化學性醫用膠固定補片和創面止血取得了較好療效，沒有因為補片固定不牢靠而復發的病例，沒有發生傷口感染，可以減輕術后疼痛，減少慢性疼痛和血腫的發生，節省了手術時間。

［1］Obilski W，Dobosz M，Wojciechowicz T，et al．Lichtenstein inguinal hemioplasty using butyl－2－cyanoacr ylate versus sut ures，preli minar y experience of a prospective rando mized trial［J］．Eur Surg Res，2004，36：367－370．

［2］王養忠，朱 預，周麗君，等．EC耳腦膠在眶壁修復術中應用［J］．中國實用眼科雜志，2004，22（5）：400．

［3］張 健，楊寶賀，秦懷海，等．醫用膠自體顱骨碎片原位粘合成形術［J］．中華神經外科雜志，1998，14（3）：178－179．

［4］李楨林，楊 蓓，范和平．丙烯酸酯類膠黏劑研究新進展［J］．河南化工，2004（7）：4－7．

［5］徐 梅，趙 敏，李 鴻．α－氰基丙烯酸正辛酯在小梁切除術中應用的初步報告［J］．眼外傷職業眼病雜志，2007，29（8）：581－583．

［6］Davis SC，Eaglstein WH，Cazzaniga AL，et al．An octyl－2－cyanoacrylate for mulation speeds healing of partialthinckness wounds［J］．Der matology Surger y，2001，27（9）：783－788． （收稿：2012－05－15）

［7］Kitamura Y，Nino miya．Smad expression of hepatic stellate cells inliver cirr hosis in vivo and hepatic stellate cell line in vitro［J］．Pathol Int，2003，53（1）：18－26．

［8］Kir wan RP，Leonard MO，Mur phy M，et al．Transf orming growthfactor－beta－regulated gene transcription and protein expression in hu man GFAP－negative lamina cribrosa cells［J］．Glia，2005，52（4）：309－324．

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