IL-17和IFN-γ在紅內期間日瘧原蟲感染者外周血T細胞亞群中的表達

孔評石夏惠

IL-17和IFN-γ在紅內期間日瘧原蟲感染者外周血T細胞亞群中的表達

孔評石1,2夏惠2★

目的 觀察分析間日瘧原蟲感染患者外周血T細胞亞群中分泌IL-17和IFN-γ的細胞的表達水平。 方法 采用流式細胞術檢測分析患者組（PV）和健康對照組（HD）外周血CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD8-和γδT細胞中分泌胞內因子IL-17、IFN-γ的細胞的百分比。 結果 在所有檢測的細胞亞群中，分泌IFN-γ的CD3+CD8-和γδT細胞在其所屬亞群中所占比例明顯高于健康對照組，分泌IL-17的γδT細胞的比例明顯高于健康對照組。 結論 本研究對于理解機體抗瘧原蟲的細胞免疫的功能狀態具有一定意義。

IL-17；IFN-γ；γδT細胞；間日瘧原蟲1,22★

瘧疾是危害人類最嚴重的寄生蟲病。盡管近年來瘧疾防治工作取得了重要進展，但惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum，Pf）每年仍造成數十萬患者死亡[1]。間日瘧是最廣泛傳播的蟲種，亦是我國主要的流行蟲種，但長期以來對間日瘧的免疫機制研究不夠深入。

瘧疾的抗感染免疫機制中存在著復雜的細胞因子效應。在以往的研究中表明IFN-γ、TNF-α、IL-12、 IL-6等多種細胞因子在抗瘧原蟲感染中發揮了重要作用，其中IFN-γ在抗瘧原蟲感染和免疫調節中發揮了重要的調節作用。近年來，IL-17在感染免疫中的作用受到越來越多的認識，但在瘧疾感染中的表達狀況卻少見報道。本研究通過對間日瘧原蟲紅內期現癥感染者外周血T細胞亞群分泌IL-17和IFN-γ的特征進行觀察分析，旨在了解間日瘧感染中的細胞因子表達特征，從而進一步理解間日瘧感染中細胞免疫和調節的機制。

1 資料與方法

1.1 實驗對象

24例間日瘧患者（PV）全血采自蚌埠市周邊縣區醫院。患者經鏡檢診斷為紅內期間日瘧原蟲感染，用肝素抗凝管抽取血樣于37℃保溫4 h內送達實驗室，經鏡檢復檢確認的血樣用于實驗。23例健康志愿者（HD）外周血取自蚌埠醫學院學生和教師。所有人群均排除肝炎與結核病史。

1.2 主要試劑和設備

1.2.1 主要實驗設備

HW0301T-VBA型CO2培養箱：美國Harris公司。FACSCalibur流式細胞儀：美國BD公司。

1.2.2 主要實驗試劑

熒光標記鼠抗人單克隆抗體：抗IFN-γ-FITC，抗IL-17A FITC，抗TCRγδ-PE,抗CD3 -PERCP，抗CD8-APC均為eBioscience公司產品。以上均為小鼠抗人單克隆抗體。佛波醇酯（PMA）、 鈣離子霉素（Ionomycin）、莫能霉素（monesin）為Sigma公司產品。

1.3 方法

1.3.1 間日瘧患者組和健康對照組細胞因子的激發和阻滯

所有樣本均取1 mL全血加1 mL含10%小牛血清的RPMI1640稀釋，置于48孔培養板，加入20 ng/mL佛波醇酯和500 ng/mL鈣離子霉素置5%CO2培養箱刺激6 h（37℃，飽和濕度），并于刺激2 h后加入2.5 mol/L莫能霉素繼續培養4 h，然后收集細胞進行細胞染色。1.3.2 流式細胞術檢測分析胞內因子

流式細胞儀檢測細胞因子按照常規方法進行，同時設置同型對照組。具體如下：100 μL患者和對照者壓積全血（各分兩管）加入PeCy5.5標記的抗CD3抗體、APC標記的抗CD8抗體和PE標記的抗TCR-γδ抗體，4℃ 避光反應20 min，加入溶血劑（BD Biosciences）室溫避光溶解紅細胞10 min，染色緩沖液（PBS-5%NBS-0.1% NaN3）洗兩次，2%多聚甲醛4℃固定30 min，染色緩沖液洗兩次，透膜緩沖液（PBS-10%NBS-0.1%皂素）4℃避光透膜15 min， 5%牛血清白蛋白和10%小鼠血清4℃避光封閉30 min，兩管分別加入FITC標記的抗IL-17A抗體和FITC標記的抗IFN-γ抗體，同型對照管加抗小鼠IgG1 FITC，4℃避光反應30 min，透膜緩沖液洗兩次，染色緩沖液洗一次，用2%的多聚甲醛200 μL重懸細胞，用流式細胞儀檢測。應用CellQuest和WinMDI 2.8軟件分析流式檢測結果，非特異性吸附從同型對照中減去。

1.4 統計學分析

采用獨立樣本t檢驗分析檢測結果，顯著性檢驗標準為0.05，用SPSS13.0軟件完成。

2 結果

2.1 IFN-γ在患者T細胞亞群中的表達

經分析，我們在對間日瘧患者全部的外周血淋巴細胞中CD3+T細胞和CD3+CD8+T亞群的觀察中沒有發現分泌IFN-γ的陽性細胞比例的變化，但發現患者組CD3+CD8-T細胞中分泌IFN-γ的細胞比例（4.52±2.26%）顯著高于對照組（2.71±1.04%），同時發現患者組γδ T細胞中分泌IFN-γ的細胞所占的比例（13.52±5.32%）亦顯著高于對照組（7.43±4.15%），見圖1、圖2。

2.2 IL-17在患者T細胞亞群中的表達

圖1 用流式細胞術分析一例間日瘧感染患者和健康對照者外周血T細胞亞群的胞內因子Figure1 Using FACS to study the intra-cellular cytokines in T cell subsets of the peripheral blood from a PV patient and that from HD.

圖2 患者組和健康對照組T細胞亞群中分泌IFN-γ的細胞比例的比較Figure2 Comparison of the proportions of cells secreteing IFN-γ in T cell subsets in PV and HD

圖3 患者組和健康對照組T細胞亞群中分泌IL-17的細胞比例的比較Figure3 Comparison of the proportions of cells secreteing IL-17 in T cell subsets in PV and HD

在對全部的CD3+T細胞、CD3+CD8+T細胞和CD3+CD8-T細胞亞群的分析中沒有發現分泌IL-17的陽性細胞比例的顯著變化，但間日瘧患者γδ T細胞中分泌IL-17的細胞所占的比例（5.88±2.13%）顯著高于對照組（3.77±1.73%），見圖1、圖3。

本實驗結果表明：急性期瘧疾患者血循環中T細胞亞群表現出胞內因子分泌模式的顯著變化，其中γδ T細胞分泌IL-17和IFN-γ顯著增高，而在CD3+CD8-T細胞中分泌IFN-γ的陽性細胞的比例增加更為顯著。

3 討論

瘧疾感染中的免疫機制研究一直受到普遍關注。以往的研究表明瘧原蟲感染中存在著復雜的細胞免疫機制和細胞因子效應。急性瘧疾感染中作為效應細胞的T細胞亞群分泌IFN-γ、TNF-α、IL-1和IL-12等細胞因子發揮了重要的抗感染作用。對惡性瘧和鼠瘧模型的研究揭示了IFN-γ在免疫保護和病理損傷中均處于中心的位置，及時而適當強度的IFN-γ響應是有效的抗原蟲反應的表現[2～3]。最早的IFN-γ是由NK細胞開始分泌，隨后是γδT細胞 （24～48 h），最后是αβT細胞（4～6天后）分泌。這些T細胞亞群細胞分泌的IFN-γ在生理濃度下誘導巨噬細胞活化以增強吞噬和殺傷感染紅細胞[4]，但IFN-γ激活巨噬細胞產生的TNF-α、IL-1、IL-6等導致炎癥級聯放大效應[5]。長期的高水平炎性因子將導致機體免疫損傷和重癥瘧疾的發生。實驗證實在惡性瘧重癥患者的PBMC培養上清和血漿中IFN-γ的水平遠遠高于無癥狀患者[6]。以往的IFN-γ研究多集中于Pf和鼠瘧感染模型實驗，直接針對p.v的細胞免疫研究較為欠缺。

IL-17是一種重要的促炎性細胞因子，相關研究報道了IL-17能夠通過招募和活化中性粒細胞、促進促炎性細胞因子、趨化因子及抗體的生成以及激活T細胞等功能對細菌、真菌、病毒等病原體發揮重要的抗感染作用和免疫調節作用[7～9]。近年來的諸多證據表明IL-17在寄生蟲感染免疫中同樣發揮著重要作用。研究發現，給感染肺孢子蟲的野生型小鼠注射抗IL-17的中和抗體后導致使感染小鼠體內的蟲荷增加，表明了IL-17的保護性作用[10]；同時作為促炎性因子IL-17在炎性病理中亦扮演了重要角色。感染曼氏血吸蟲繼而用可溶性血吸蟲卵抗原免疫的小鼠會由IL-17介導發生炎性肉芽腫，導致嚴重的免疫病理損傷[11]。IL-17受體缺損的小鼠對剛地弓形蟲易感性提高，但同時病理損傷亦減輕，同樣證明了寄生蟲可通過誘導產生高水平的IL-17應答參與免疫病理過程[12]。盡管現有的證據似乎足以證實IL-17在寄生蟲感染免疫過程中至關重要的保護性和炎性病理的雙向效應，但IL-17在瘧疾免疫中扮演的角色至今很少受到關注。

我們先前在實驗中發現，間日瘧患者血清中的IFN-γ和IL-17均顯著高于健康對照者，提示IFN-γ和IL-17均參與了抗p.v免疫應答，但增高的細胞因子來源并不清楚。在本實驗中對T細胞亞群分泌細胞因子的觀察中我們發現，間日瘧原蟲感染者分泌IFN-γ的CD3+CD8-T細胞比例顯著高于健康對照組，分泌IL-17和IFN-γ的γδT細胞比例亦顯著高于對照組，部分顯示了在p.v感染中細胞因子來源的特定模式。Bueno等[13]最近在對美洲間日瘧感染者的研究中發現產生IL-17的CD4+T細胞在美洲間日瘧急性感染病人外周血中顯著增加，并與產生IFN-γ的CD4+T細胞數量密切相關，該結果提示產生IFN-γ和IL-17的T細胞亞群參與的細胞因子效應的平衡在保持適度的炎性響應和控制原蟲血癥的發展中具有重要意義，亦在一定程度上與我們的實驗結果相為佐證。

以往的研究已經證實γδT細胞是IFN-γ的重要來源，近年來越來越多的證據表明γδT細胞也是IL-17的重要來源。Schulz等[7]發現γδT細胞通過分泌IL-17在沙門氏菌腸炎的保護性免疫中發揮效應；Peng等[14]認為結核病人中異常增多的分泌IL-17的γδT細胞參與了抗結核免疫和結核病的病理過程。本實驗通過對胞內因子的檢測分析初步顯示了IL-17和IFN-γ在各淋巴細胞亞群表達狀況，證明了在間日瘧感染中作為非特異性免疫的重要組成部分的γδT細胞是IL-17和IFN-γ的重要來源，同時CD3+CD8-T細胞也是IFN-γ的重要來源。這種分泌IL-17和IFN-γ的細胞比例的增多在間日瘧感染過程中是發揮協同保護性的作用抑或傾向于造成炎性病理損傷仍有待于進一步的確認；而是否能夠在病程的不同階段通過干預T細胞亞群的細胞因子分泌來有效地控制原蟲血癥和降低炎性病理的發生亦有待于更深入的研究。

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Expressions of IL-17 and IFN-γ in the T cell subset in the peripheral blood of patients infected with blood-stage plasmodium vivax

KONG Pingshi, XIA Hui
(1.The Second Tranditional Chinese Medicine Hospital of Jiangsu, Jiangsu, Nanjing 210017, China; 2.Pathogen Biology Laboratory of Bengbu Medical College, Anhui, Bengbu, 233030, China)

Objective To investigate the expressions of T cell subset which secretes IL-17 or IFN-γ in the peripheral blood of patients infected withplasmodium vivax (p.v). Methods Using FACS to detect the proportion of the cells secreteing intra-cellular cytokines IL-17 or IFN-γ of CD3+, CD3+CD8+, CD3+CD8-and γδT cells in the T cell subset of peripheral blood from patients infected withp.vand healthy donors. Results Among all of the detected T cell subsets of PV, the proportion of the CD3+CD8-T cells and γδT cells secreteing IFN-γ and the γδT cells secreteing IL-17 were higher than that of HD. Conclusion This analysis furthers people's understanding of the function of anti-p.vcellular immunity of human beings.

IL-17; IFN-γ; γδT;Plasmodium vivax

安徽省教育廳自然科學研究重點資助項目（kj2012-A-200）

1.江蘇省第二中醫院檢驗科，江蘇，南京 210017 2.蚌埠醫學院病原生物學教研室，安徽，蚌埠 233030

★通訊作者：夏惠，E-mail: landsky0330@163.com