氯沙坦對晚期糖基化終產物誘導足細胞α-actinin-4表達的干預作用

成彩聯 鄭振達 石成鋼 葉增純 李燦明 婁探奇★

2.中山大學附屬第三醫院心內科，廣東，廣州 510630

足細胞是附著在腎小球基底膜外側高度分化的細胞，足細胞和足突間的裂孔隔膜是構成腎小球濾過膜的最后一道屏障，多種重要的足細胞相關蛋白異常與蛋白尿的發生密切相關。晚期糖基化終產物（advanced glycation end-products，AGEs）是高糖環境下的重要產物，參與糖尿病腎病的發生發展。Mundel等[1,2]認為足細胞的細胞骨架破壞可引起足突融合，導致裂孔隔膜結構消失，并破壞濾過膜的完整性，出現蛋白尿。本研究旨在觀察AGEs對足細胞骨架相關蛋白α-actinin-4的影響，并進一步探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

本研究采用的小鼠原代培養足細胞株MPC5由中山大學余學清教授惠贈。選用德國 Merck的AGEs，美國MP Biomedicals的細胞培養級牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA），美國 Proteintech Group的兔抗大鼠3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體，美國Sigma-Aldrich的兔抗α-actinin-4多克隆抗體、小鼠γ–干擾素、氯沙坦（Losartan）和結晶紫，美國Invitrogen的Rhodamine鬼筆環肽，美國Jackson ImmunoResearch的DyLight 488山羊抗小鼠IgG，以及德國META ZEISS的激光共聚焦顯微鏡LSM510。

1.2 細胞培養及實驗分組

在33℃培養箱里，把足細胞放入含10 U/mLγ–干擾素（美國Sigma）10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中傳代培養，然后轉至不含γ–干擾素的10%胎牛血清RPMI 1640培養液，在37℃分化10～14天，取分化成熟的足細胞進行實驗。實驗分為不同濃 度 的 AGEs組（0，20，40，80 μg/mL）和 BSA 組，用Western blot及免疫熒光技術檢測α-actinin-4和F-actin，經氯沙坦預處理后，觀察α-actinin-4和F-actin的改變。

1.3 Western blot

按說明書提取蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，封閉，兔抗鼠α-actinin-4（1︰200），辣根過氧化物酶標記二抗（1︰60000）室溫孵育1 h，TBST洗3次，顯影、定影。用BioRad掃描儀掃描膠片，應用Quantity One圖像分析軟件對特異性條帶進行灰度掃描，以目的蛋白條帶與GAPDH 蛋白條帶灰度值的比表示其相對含量。

1.4 免疫熒光共聚焦檢測

將0.1% 明膠溶液包被蓋玻片放入六孔板中，加入等量消化好的細胞懸液，待其貼壁生長至70%左右，同步化過夜，加處理因素培養24 h，依次經4%多聚甲醛固定，0.25% Triton X-100打孔，封閉，孵育一抗α-actinin-4（1︰100）和 Rhodamine鬼筆環肽，孵育DyLight 488山羊抗小鼠IgG（1︰1000），Hoechst 33342染核，滴少量抗熒光淬滅劑，指甲油封邊，激光共聚焦顯微鏡下觀察結果并掃描采集圖像。

1.5 統計學方法

所有數據均代表3次以上重復實驗結果，以均數±標準差表示。采用SPSS16.0統計軟件，多個樣本均數的比較采用One-Way ANOVA方法，兩兩比較采用LSD方法。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度AGEs對足細胞α-actinin-4的影響

不 同 濃 度 的 AGEs（0，20，40，80μg/mL）干預小鼠的足細胞24 h后，用western blot法檢測α-actinin-4的蛋白表達，結果顯示：與對照組比較，AGEs（80μg/mL）能明顯下調足細胞α-actinin-4的表達（P＜0.05），而BSA對α-actinin-4的蛋白表達沒有明顯影響（P＞0.05），見圖 1、表 1。

圖1 不同濃度AGEs對足細胞α-actinin-4的影響Figure 1 Effects of advanced glycation end products on α-actinin-4 expression in podocytes

表1 AGEs對足細胞α-actinin-4表達的影響Table 1 Effect onα-actinin-4 expression with different concentration of advanced glycation end products in podocytes

2.2 氯沙坦對AGEs介導α-actinin-4的影響

小鼠足細胞經氯沙坦（100μmol/L）預孵育60 min后，加入AGEs（80μg/mL）作用24 h，結果顯示：AGEs能明顯下調α-actinin-4的表達（P＜0.05），氯沙坦預處理能明顯減輕AGEs介導的α-actinin-4的下調程度（P＜0.05），見圖 2、表 2。

圖2 氯沙坦對AGEs介導α-actinin-4的影響Figure 2 Effects of losartan on α-actinin-4 expression induced by advanced glycation end products in podocytes

表2 氯沙坦減輕AGEs介導的足細胞α-actinin-4的下調Table 2 Losartan alleviated the downregulation of α-actinin-4 induced by advanced glycation end products in podocytes

2.3 氯沙坦對AGEs介導的足細胞骨架蛋白重構的影響

小鼠足細胞經氯沙坦（100μmol/L）預孵育60 min后，加入 AGEs（80 μg/mL）作用 24 h，激光共聚焦顯微鏡結果顯示：AGEs引起α-actinin-4從膜周向胞核、核周遷移，F-actin從有序的平行狀纖維束重構為雜亂無序的網狀物；氯沙坦預處理能減輕AGEs介導的的α-actinin-4的重分布，減少F-actin的重構，見圖 3。

圖3 AGEs對足細胞骨架蛋白重構的影響（×630）Figure 3 Effects of advanced glycation end products on cytoskeleton reorganization (×630)

3 討論

足細胞損傷在糖尿病腎病的發病中起著重要的作用，AGEs可直接作用于腎小球的足細胞，導致足細胞的凋亡、脫落。足突細胞骨架主要由F-actin組成，synaptopodin和α-actinin-4將F-actin連接在一起。足突的任何一個結構域發生功能障礙，都將引起肌動蛋白從并聯的收縮蛋白束變成致密的網狀結構，并伴有足突融合和蛋白尿。有研究發現用白藜蘆醇穩定足細胞骨架蛋白α-actinin-4的表達，可阻止TGF-β1誘導的足細胞的凋亡[3]。因此闡明足細胞骨架重構的機制對于足細胞的防護具有重要的意義。

α-actinin-4是一種肌動蛋白微絲交聯蛋白，能將松散的肌動蛋白纖維捆扎成具有收縮作用的纖維束，具有調節足突機械動力的作用。α-actinin-4同時和大量的細胞骨架、細胞表面及信號傳導分子相互作用。α-actinin-4在胞內一方面與基底膜的整合素復合物相作用，另一方面又能與裂孔隔膜復合物相連，從而將足細胞的兩個部分連接在一起，提示α-actinin-4在上皮細胞足突末端的肌動蛋白微絲與整合素的錨定中起重要作用。

本研究通過以不同濃度的AGEs干預小鼠足細胞24 h，結果發現，80 μg/mL AGEs能明顯下調α-actinin-4的表達，并使α-actinin-4從膜周向胞漿內、核周遷移，足細胞F-actin肌動蛋白由平行排列的纖維束變為雜亂無序的網狀物。α-actinin-4的減少和F-actin的重構導致細胞從穩定表型轉變為遷移表型，細胞的遷移性增加，導致骨架蛋白的高轉運，消耗能量，終使足細胞脫落。有研究發現糖尿病腎病腎組織α-actinin-4表達下降與蛋白尿和腎小球病變密切相關，α-actinin-4的改變會導致濾過屏障破壞、足突的消失和蛋白尿，并逐漸出現腎小球硬化、腎衰竭和動物死亡，而且異常表達的α-actinin-4與肌動蛋白纖維絲的結合力增強形成聚合體，變得不穩定且容易被蛋白酶降解，并促進足細胞的凋亡[4～5]。Dandapani等[6]發現先天α-actinin-4缺乏小鼠與野生鼠相比，每個腎小球足細胞的數量減少，整合素磷酸化減少，而且在壓力不斷增加的情況下，足細胞黏附于基底膜的能力下降，提示肌動蛋白細胞骨架可通過影響足細胞的結構或功能，參與蛋白尿的發生和發展。這些研究結果提示α-actinin-4的減少與足細胞的損傷、蛋白尿的發生、腎小球的硬化均有密切關系。

足細胞肌動蛋白骨架處于動態變化中，早期足細胞的形態改變，如足突融合、裂孔隔膜斷裂是可逆的，持續性損傷將導致足細胞凋亡或從基底膜上脫落，最終進展為腎小球硬化和終末期腎衰竭。如果能在一定時間內去除損傷因素，則重構的骨架蛋白會恢復，足細胞的功能改善。因此，研究細胞骨架重構的調節機制對于足細胞的防護具有重大的意義。Mifsud等[7]研究發現纈沙坦可減輕鏈脲佐菌素誘導糖尿病大鼠腎小球基底膜裂孔隔膜的單位長度，保護了足突的結構。血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑雖然廣泛應用于腎臟疾病的治療，但對足細胞骨架蛋白的影響研究不多。因此，觀察其對足細胞在腎小球疾病過程中的病變作用及其機制的深入了解，必將為腎小球硬化的防治研究開辟廣闊的前景。我們觀察了血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑氯沙坦對AGEs介導足細胞骨架蛋白的影響。結果發現，氯沙坦預處理足細胞后，AGEs介導的α-actinin-4的下調程度明顯減輕，α-actinin-4的重分布減少，F-actin重新恢復為平行排列狀。有研究[8]發現Ang Ⅱ通過氧化應激激活rac1和ezrin/radixin/moesin（ERM）通路促使肌動蛋白細胞骨架的重構。這些結果提示足細胞內的腎素-血管緊張素系統激活可能參與了AGEs介導的足細胞骨架蛋白的重構和遷移性，減輕AGEs對足細胞骨架的影響可能是氯沙坦減少蛋白尿的另一作用機制。

綜上所述，我們的結果發現，AGEs可以下調α-actinin-4的表達并介導骨架蛋白的重構，而氯沙坦預處理可減輕AGEs介導的足細胞的這些損傷性變化。足細胞組成腎小球濾過膜的最后一道屏障，其損傷不但導致蛋白尿的出現，而且是腎小球硬化的核心環節。闡明足細胞損傷的分子機制，對于尋求更為有效的治療方法，阻止腎小球疾病的慢性進展，進而改善慢性腎臟病患者的生存質量有重大意義。

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