生活方式干預(yù)與細胞免疫功能的相關(guān)性研究

石婷婷曾麗英★莫蕓羅旋景尉鐘惠珠何桂兒

生活方式干預(yù)與細胞免疫功能的相關(guān)性研究

石婷婷1曾麗英1★莫蕓2羅旋1景尉1鐘惠珠3何桂兒4

目的 探討健康生活模式對機體自然清除HPV病毒的價值。 方法 對HPV感染者隨機分為干預(yù)生活方式實驗組和對照組，分別對實驗組和對照組進行宮頸分泌物T淋巴細胞及其亞群（CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+）定量檢測，半年后復(fù)查宮頸HPV病毒和宮頸分泌物T淋巴細胞及其亞群定量檢測。結(jié)果 實驗組的HPV病毒清除顯著高于對照組（P＜0.01）；實驗組和對照組在干預(yù)治療前CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+組間均無顯著性差異；實驗組干預(yù)治療后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+較實驗前顯著升高（P＜0.01），而CD8+顯著下降（P＜0.01）；對照組在實驗前后CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+均無顯著性差異（P＞0.05）。 結(jié)論 對HPV感染者進行生活方式干預(yù)治療，有助于患者免疫能力的改善和病毒的清除，降低宮頸癌病變和宮頸癌的發(fā)生。

HPV感染；自然清除；T淋巴細胞

眾所周知，宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅女性身體的健康和生命，據(jù)統(tǒng)計每年有近50萬新發(fā)病例，而總體5年生存率在5%左右[1]。已有研究證明99%的宮頸癌組織中可檢出人類乳頭狀病毒（Human Papillomavirus, HPV），HPV感染尤其是高危型HPV持續(xù)性感染是宮頸癌前病變和宮頸癌發(fā)生的必要條件；女性一生中曾HPV感染高達80%[2]。雖然大多數(shù)HPV感染者能在一定的時間內(nèi)把體內(nèi)的病毒自然清除掉，但是有少數(shù)的患者持續(xù)感染最終演變成宮頸癌前病變和宮頸癌，所以也可以說宮頸癌是一種感染性疾病，但由于病毒的變異及其本身的特殊結(jié)構(gòu)，使目前對HPV的感染尚無特殊有效的藥物治療，必須依靠機體天然的免疫力去清除體內(nèi)的病毒。在正常情況下，當機體遭受病原體入侵以后，必然產(chǎn)生免疫應(yīng)答，即產(chǎn)生細胞毒性T淋巴細胞及分泌抗體B淋巴細胞，以阻止感染和清除被感染的細胞。大量的臨床經(jīng)驗證明，相同的感染條件下，機體免疫力的強弱決定著疾病的轉(zhuǎn)歸。本研究組擬對HPV感染者的生活方式進行干預(yù)，以探討干預(yù)治療方式對改善機體的免疫抵抗力，提高宮頸分泌物中T淋巴細胞的含量而使機體具有清除HPV的臨床價值，從而阻斷宮頸癌前病變和宮頸癌的發(fā)生。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機選擇2010年9月～2012年9月我院婦科門診普查發(fā)現(xiàn)的HPV陽性感染者258例，并排除自身免疫性疾病、其他生殖道病毒感染、腫瘤、糖尿病及結(jié)核等可能影響機體免疫力的疾病，所有患者就診前均未接受任何針對該病的物理及化學(xué)藥物治療，按就診日期隨機分組，其中生活方式干預(yù)實驗組158例，非干預(yù)對照組100例。生活方式干預(yù)：（1）每周至少有氧運動4次，每次半小時以上；（2）每天安安靜靜聽自己喜歡的音樂半小時以上；（3）按時睡眠，每天23:00之前進入睡眠；（4）不吸煙，不酗酒；（5）如果不能按要求做到的患者，退出實驗組；（6）利用先進的通訊工具，每半個月溫馨提醒一次實驗者嚴格按照質(zhì)量完成生活方式干預(yù)的措施。

1.2 方法

所有HPV陽性的患者均用無菌拭子采集宮頸分泌物置于無菌試管中，獲得宮頸脫落細胞，進行宮頸分泌物T淋巴細胞及其亞群檢測，然后隨機進入實驗組或?qū)φ战M。半年后所有患者均復(fù)查宮頸分泌物HPV病毒和T淋巴細胞及其亞群檢測。

1.2.1 T淋巴細胞及其亞群檢測

本研究中T淋巴細胞及其亞群采用流式細胞術(shù)，選用美國BD公司BD FACSCalibur流式細胞儀及其配套試劑檢測。操作方法：（1）取流式細胞儀專用的12 mm×75 mm試管（Falcon管），按標本順序編號。（2）給試管里面加入2 mL PBS，將分泌物拭子在PBS里面來回混蕩，盡量將拭子上的細胞混散在PBS里面，弄完后200 g離心力離心5 min，倒掉上清液。（3）給試管里面加入10 μL 抗體，混勻避光孵育30 min，時間到后加入2 mL PBS，200 g離心力離心5 min，倒掉上清液，然后加入450 μL的1%多聚甲醛固定液，即可上機檢測，如不能及時檢測，可放4℃冰箱24 h內(nèi)上機檢測。

1.2.2 HPV DNA熒光定量PCR

采用的是實時熒光定量PCR技術(shù)，選用儀器為Applied Biosystems公司的7500 Real-Time system，試劑由中山大學(xué)達安基因股份有限公司提供。所使用引物為：正向引物5'-GTTATCGCCTCCCCCAAAT-3'，反向引物5'-ATCTGGCTTTTCCTTTTCAGG-3'。操作方法：（1）標本處理：將粘有分泌物的棉拭子置于1 mL生理鹽水中充分震蕩搖勻，擠干棉拭子中的水分，棄棉拭子，轉(zhuǎn)移液體至離心管中，12 000 rpm離心5 min，棄盡上清，重復(fù)洗滌一次后，在沉淀中加入50μL DNA提取液，充分混勻，100℃沸水浴10 min， 10 000 rpm離心5 min，取上清2 μL做PCR反應(yīng)。（2）PCR反應(yīng)：按比例取相應(yīng)量的PCR反應(yīng)液及Taq酶，充分混勻后按43 μL/管分裝至0.2 mL離心管中備用。取準備好的試劑于0.2 mL離心管中，加入處理后的樣品上清液2 μL，8 000 rpm離心數(shù)秒按下列條件擴增：93℃ 2 min預(yù)變性，然后按93℃ 45 s→55℃60 s做10個循環(huán)，93℃ 30 s→55℃ 45 s做30個循環(huán)。（3）Real-Time system檢測分析：設(shè)置好分析條件，在Analysis菜單下選擇Analyze自動分析結(jié)果。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用 SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件，實驗組與對照組間、治療前后比較采用配對t檢驗，兩組間比較采用成組t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 宮頸分泌物中T淋巴細胞及其亞群的結(jié)果

通過流式細胞分析儀對宮頸分泌物中的淋巴細胞含量及其亞群進行分析，可由檢測系統(tǒng)直接計算得到。本研究采用的檢測系統(tǒng)結(jié)果顯示見圖1，提示該樣本的T淋巴細胞Gate值為15%，在總細胞比例為15%。其中CD3+的Gate值為23.72%，CD3+CD8+的Gate值為10.7%，CD3+CD4+的Gate值11.63%。

2.2 宮頸分泌物中HPV病毒定量檢測結(jié)果曲線圖

HPV病毒定量的結(jié)果判定主要依據(jù)增長曲線和CT值，當增長曲線不成S型或CT值為30，HPV病毒含量低于檢測范圍，視為陰性。反之當增長曲線成S型或CT值小于30，HPV病毒視為陽性。檢測系統(tǒng)結(jié)果顯示見圖2，該標本的增長曲線為S型，CT值約為15，提示為強陽性結(jié)果。

2.3 實驗前后宮頸分泌物中CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+含量情況

實驗組和對照組在生活方式干預(yù)治療前CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+組間均無顯著性差異；實驗組干預(yù)治療后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+較實驗前顯著升高（P＜0.01），而CD8+則顯著下降（P＜0.01）；對照組在實驗前后CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+均無顯著性差異（P＞0.05），見表1。

2.4 實驗組和對照組HPV感染轉(zhuǎn)陰性情況

圖1 T淋巴細胞及其亞群檢測結(jié)果Figure 1 The test results of T lymphocytes and its subtypes

實驗組的HPV患者轉(zhuǎn)陰比例46.2%顯著高于對照組的27.0%，表明實驗組的HPV病毒清除率顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表 2。在治療前，實驗組與對照組在數(shù)量和比例上無顯著性差異，提示宮頸局部的免疫功能相當。在實驗前后，對照組T淋巴細胞及其亞群在數(shù)量和比例上基本保持不變，尤其是CD4+、CD8+T淋巴細胞無顯著性差異，表明宮頸局部的免疫功能并無改變。經(jīng)過生活方式干預(yù)療法之后，實驗組T淋巴細胞的含量有顯著性改變，發(fā)揮抗腫瘤作用的CD4+含量顯著性增加，抑制機體抗腫瘤作用的CD8+含量顯著性降低，兩者的比例顯著性升高，表明宮頸組織局部免疫力得到增強。這個結(jié)果也充分印證了表2數(shù)據(jù)出現(xiàn)的必然性。通過對實驗結(jié)果的分析，可以得知健康的生活模式確實能夠提高宮頸組織局部免疫力。

3 討論

當HPV病毒入侵機體時，機體會及時啟動自身免疫系統(tǒng)，而T淋巴細胞在機體免疫系統(tǒng)內(nèi)發(fā)揮著中心調(diào)控作用，是機體免疫的重要效應(yīng)細胞[3～4]，它所介導(dǎo)的細胞免疫反應(yīng)在殺傷腫瘤細胞、控制腫瘤生長中起重要作用[5]。當機體免疫系統(tǒng)與病毒抗爭失敗時，T淋巴細胞及其亞群的數(shù)量、功能會發(fā)生改變，從而導(dǎo)致 HPV持續(xù)性感染乃至誘導(dǎo)宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展。

圖2 宮頸分泌物中HPV病毒定量檢測結(jié)果曲線圖Figure 2 Graph of quantitative determination with HPV in cervical secretions

表2 實驗組和對照組HPV感染轉(zhuǎn)陰性情況比較Table 2 Compared of the HPV negative infection in intervention group and control group

表1 實驗組和對照組實驗前后宮頸分泌物中CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的變化Table 1 Change in cervical secretions of CD3+, CD4+, CD8+, CD4+/CD8+in intervention group and control group before and after experiment

T淋巴細胞在胸腺發(fā)育過程中，產(chǎn)生了 CD4+和CD8+兩大亞群[6]。兩大亞群在抗腫瘤反應(yīng)中作用各不相同，但相互協(xié)調(diào)、相互制約，共同參與對機體免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用，反映了機體抗腫瘤免疫狀態(tài)的總體水平[7]。有研究表明，T 淋巴細胞亞群狀態(tài)異常和比例失調(diào)的現(xiàn)象，在混合多種腫瘤患者中較為明顯[8～10]。與正常人相比，宮頸癌患者 T淋巴細胞中CD4+細胞減少、CD8+細胞升高，CD4+/CD8+降低。Passmore等[11]研究證實，宮頸處和血液中的CD4+細胞和CD8+細胞對 HPV16 E7抗原的反應(yīng)強度相似，且有明顯相關(guān)性。在宮頸癌及其癌前病變的腫瘤微環(huán)境中，CD4+細胞逐漸減少，輔助細胞免疫及體液免疫的作用受到影響，T細胞各亞群之間平衡紊亂，抑制了機體的抗腫瘤免疫，上述情況破壞了宮頸組織局部免疫微環(huán)境的平衡，最終導(dǎo)致宮頸病變，也有利于腫瘤的進展、侵襲或轉(zhuǎn)移。所以，在宮頸癌研究中，研究人員需要關(guān)注宮頸局部的免疫功能改變，并分析其對疾病轉(zhuǎn)歸的影響。在本研究中，實驗組進行生活方式干預(yù)后宮頸分泌物CD3+、CD4+水平升高：CD3+T（總T細胞淋巴細胞）、CD4+T（輔助性T細胞/Th）升高，細胞免疫應(yīng)答增強；CD8+水平下降：CD8+T（細胞毒性T細胞/Tc和抑制性T細胞/Ts）下降，免疫抑制作用減弱，提示機體局部免疫作用增強，有利于對HPV病毒的自然清除。故我們對所有的患者均進行了HPV病毒的檢測，實驗結(jié)果也表明，實驗組的HPV清除率顯著高于對照組。從這兩個不同方面的檢測結(jié)果來看，它們之間也是相互印證的，更有力的支持實驗組宮頸局部的免疫力得到增強的這個結(jié)論。綜上所述，增強宮頸局部的免疫功能就能提高人體對HPV病毒的自然清除。

本研究試行的生活方式從運動、心境、睡眠等幾個方面來改善生活質(zhì)量，提倡進行適宜的運動、動靜結(jié)合、充足的睡眠和輕松愉快的音樂環(huán)境等，這些措施是希望可以使人在疲勞中恢復(fù)過來，使受損的細胞恢復(fù)，從而發(fā)揮其免疫功能，提示我們良好的生活方式有助于全面提高人體的免疫力，增強對各種致病因素的清除。而由于目前國內(nèi)外并無宮頸移行帶T淋巴細胞含量的參考值，甚至關(guān)于宮頸移行帶T淋巴細胞的報道都很少，所以本研究還有待進一步的深入，但本研究希望能通過一種積極的生活態(tài)度、良好的生活習(xí)慣來提高人們的免疫力，增強對癌癥的戰(zhàn)斗力。

[1] Ferlay J, Shin H R, Bray F, et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008[J]. Int J Cancer, 2010, 127 (12): 2893-2917.

[2] 吳克復(fù). “炎癥與腫瘤”的研究現(xiàn)狀及其對腫瘤防治的啟示[J]. 白血病.淋巴瘤, 2005, 14(5): 257-261.

[3] Kane K L, Ashton F A, Schmitz J L, et al. Determination of natural killer cell function by flow cytometry[J]. Clin Diagn Lab Immunol, 1996, 3(3): 295-300.

[4] Decensi A, Costa A. Recent advances in cancer chemoprevention, with emphasis on breast and cancer[J]. Eur J Cancer, 2002, 3 (6): 694-709.

[5] 孟斐. 宮頸病變患者SHP-2與CD4+T表達意義的研究[J].當代醫(yī)學(xué), 2010, 16(31): 46-47.

[6] Chi T H, Wan M, Zhao K, et al. Reciprocal regulation of CD4/CD8 expression by SWI/SNF-like BAF complexes[J]. Nature, 2002, 418(6894): 195-199.

[7] Ohwada S, Iino Y, Nakamura S, et al. Peripheral blood T cell subsets as a prognostic factor in gastric Cancer[J]. Jpn J Clin Oneol, 1994, 24(1): 7-11.

[8] 陳復(fù)興, 劉軍權(quán), 周忠海, 等. 癌癥患者T細胞亞群的臨床意義[J]. 細胞與分子免疫學(xué)雜志, 2002, 18(1): 55.

[9] 孫林, 溫江濤, 劉海紅. 乳腺癌患者外周血T淋巴細胞及NK細胞的檢測及其臨床意義[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué), 2006, 14(9): 1069-1071.

[10] 何球藻, 吳厚生, 曹雪濤. 細胞與分子免疫學(xué)[M]. 上海: 上海科學(xué)技術(shù)文獻出版社, 1997: 146.

[11] Passmore J A, Milner M, Denny L, et al. Comparison of cervical and blood T-cell responses to human papillomavirus-16 in women with human papillomavirusassociated cervical intraepithelial neoplasia[J]. Immunology, 2006, 119(4): 507-514.

A study of the association between life style intervention and cellular immune function

SHI Tingting1, ZENG Liying1★MO Yun2, LUO Xuan1, JING Wei1, ZHONG Huizhu3, HE Guier4
(1.Department of Clinical Laboratory, Yuexiu Maternity & Child Health Care Hospital, Guangdong, Guangzhou 510055, China; 2.Department of Gynaecology and Obstetrics, Yuexiu Maternity & Child Health Care Hospital, Guangdong, Guangzhou 510055, China; 3.Department of Clinical Laboratory, Guangzhou Maternity & Child Medical Center, Guangdong, Guangzhou 510620, China; 4.Department of Clinical Laboratory, Hexian Memorial Hospital, Guangdong, Guangzhou 511400, China)

Objective To investigate the effect of life style intervention on the ability of immune system to clear up HPV. Methods 258 patients with histologically confirmed HPV infection were recruited and randomly divided into intervention group and control group. Samples of cervical secretion were collected and total T lymphocytes and its subgroups and HPV were quantified using flowcytometry and real time PCR respectively. The measurement was repeated after 6 months. Results HPV clearance in the intervention group was significantly higher than the control group (P＜0.01). No difference was identified between the two groups regarding the total and subgroups of T lymphocytes. Additionally, the treatment could significantly improve the counts of T lymphocytes in the intervention group (P＜0.01), while such effect was not observed in the control group. Conclusion Life-style intervention could improve the immune function and help to clear up the viruses in the HPV-infected patients.

HPV infection; Spontaneous clearance; T lymphocytes

廣東省廣州市越秀區(qū)科技和信息化局醫(yī)療衛(wèi)生類基金（2010-WS-006）

1.越秀區(qū)婦幼保健院，檢驗科，廣東，廣州 510055 2.越秀區(qū)婦幼保健院，婦產(chǎn)科，廣東，廣州 510055 3.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，檢驗科，廣東，廣州 510620 4.番禺區(qū)何賢紀念醫(yī)院，檢驗科，廣東，廣州 511400

★通訊作者：曾麗英，E-mail:18925029249@189.cn