Cullin-1和Skp2在鼻咽癌及癌前病變組織中的表達

汪蕓王書芹 周小軍 王靜 畢超 禤瑞霞 陳鈺煒 盧金文 包貴賢

Cullin-1和Skp2在鼻咽癌及癌前病變組織中的表達

汪蕓★王書芹 周小軍 王靜 畢超 禤瑞霞 陳鈺煒 盧金文 包貴賢

目的 探討細胞周期蛋白Cullin-1（Cul-1）和S期激酶相關蛋白2（Skp2）在鼻咽癌及癌前病變組織中的表達及意義，同時對比它們在鼻咽癌及癌前病變組織中的表達水平，比較二者的分布情況，找出其差異性及相關關系。 方法 應用免疫組化方法檢測Cul-1和Skp2蛋白在20例分化型癌、20例未分化癌和20例鼻咽癌前病變中的表達。 結果 在20例分化型癌、20例未分化癌和20例鼻咽癌前病變中Cul-1的平均陽性表達率分別為76% 、77%、54%；陽性表達值分別為1.63±0.7、1.62±0.68、1.15±0.64，Cul-1在2種鼻咽癌中的表達高于癌前病變，差異有統計學意義（P＜0.05），2種鼻咽癌之間無差異；Skp2在20例分化型癌、20例未分化癌和20例鼻咽癌前病變中的平均陽性表達率為32%、41%、33%，平均陽性表達值分別為0.53±0.49、0.82±0.54、0.72±0.43，無統計學差異。對20例分化型鼻咽癌標本Cul-1、Skp2陽性表達值進行相關關系分析，兩者相關性不顯著。 結論 Cul-1參與了鼻咽癌發生、發展，Skp2則可能參與了鼻咽癌的發生過程，它參與的細胞周期調節可能是鼻咽癌發生的早期事件；兩種蛋白因子在細胞周期調控中的關系有待進一步驗證。

鼻咽癌；癌前病變；Cul-1；Skp2

腫瘤是細胞生長失控產生的新生物，細胞分化、凋亡的異常都參與了腫瘤的發生、發展，其中細胞周期的紊亂是最主要的發生機制。細胞周期蛋白（cullin-1，Cul-1）參與腫瘤發生、發展過程[1]，S期激酶相關蛋白2（S-phase kinase associated protein 2，Skp2）參與了細胞周期多個環節的調控[2]。因為其重要性，大量實驗研究從蛋白和基因水平探索細胞周期調控的各個環節，希望能從細胞周期的調控中找到鼻咽癌發生、發展、演進的原因，為其預防、診斷治療提供新線索。

1 材料與方法

1.1 病例樣本

取我院2007年至2012年病理確診為鼻咽癌的活檢標本40例，其中病理組織學類型為分化型非角化性鼻咽癌的20例，診斷為未分化型鼻咽癌的20例，取確診為癌前病變的活檢標本20例，鼻咽癌及癌前病變的診斷標準按照國家抗癌協會制定的標準執行[3]，所有標本均作3 μm連續切片。

1.2 主要試劑

Skp2（ZM-0454）鼠抗人單克隆抗體，克隆號1G12E9，抗原修復液1 mM EDTA（pH9.0）購自中杉金橋生物技術有限公司；Cul-1（產品編號：RAB-0513）兔抗人多克隆抗體（濃縮液）、抗體稀釋液（產品編號：ABD-0030）；免疫組化試劑盒：即用型快捷免疫組化MaxVisionTM2試劑盒（鼠/兔）（產品編號：KIT-5920/5930），均由福州邁新生物技術有限公司提供。

1.3 方法

Cul-1的染色方法：利用人正常扁桃體組織標本作為陽性對照，用PBS代替一抗作空白對照，Cul-1兔抗人多克隆抗體濃縮液以1∶50的比例，用抗體稀釋液稀釋后使用，現配現用。Skp2的染色方法：利用本院病理檢查確診為乳腺癌的組織標本作為陽性對照，用PBS代替一抗作空白對照。抗原修復：Skp2鼠抗人單克隆抗體采用堿性修復方法，即1 mM EDTA（pH 9.0）高壓熱修復方法。

即用型快捷免疫組化MaxVisionTM2試劑盒（鼠/兔）由福州邁新生物技術公司提供，免疫組化染色步驟嚴格按照試劑盒說明的染色步驟操作（說明書編號：40461a）。

1.4 判斷標準及統計方法

Skp2蛋白和Cul-1蛋白的表達均以細胞核中出現棕黃色顆粒作為陽性細胞。在光學顯微鏡400倍視野下，每個切片隨機選取5處視野，辨別陽性細胞和陰性細胞并計算每個視野的陽性表達率。計算方法：先數出5處高倍視野中陽性細胞和陰性細胞總數，陽性表達率=陽性細胞數/（陽性細胞數+陰性細胞數）×100%。同時對每張切片的陽性表達染色強度進行評分，陰性為0分，淺黃色1分，深黃色2分，黃褐色為3分。陽性表達率×染色強度分值=陽性表達值[4]。

用SPSS19.0軟件系統進行數據處理，對Skp2和Cul-1在鼻咽癌及癌前病變標本中的陽性表達值以t檢驗進行統計分析，并進行每兩組之間的比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。相關關系采用Pearson Correlation Coefficient（PCC）方法。

2 結果

Cul-1蛋白在分化型癌、未分化癌及癌前病變中的平均陽性表達率分別為76%、77%、54%；平均陽性表達值分別為1.63±0.7、1.62±0.68、1.15±0.64，Cul-1蛋白在兩種類型鼻咽癌中的表達均高于癌前病變，差異有統計學意義（P＜0.05），而在兩種類型鼻咽癌之間，統計無差異。

Skp2蛋白在分化型癌、未分化癌及癌前病變中的平均陽性表達率分別為32%、41%、33%，陽性表達值分別為0.53±0.49、0.82±0.54、0.72±0.43；Skp2蛋白在兩種類型鼻咽癌及癌前病變中的陽性表達值兩兩比較均無統計學差異（P＞0.05）。

在2種類型鼻咽癌及癌前病變的同一樣本配對資料中，比較Cul-1和Skp2陽性表達值，計算Pearson相關系數定量分析兩組之間的陽性表達，其結果在0.05 水平（雙側）上均無顯著相關。Cul-1和Skp2在鼻咽癌及癌前病變中的表達，見圖1。

3 討論

圖1 Cul-1和Skp2在鼻咽癌及癌前病變中表達Figure 1 Expression of Cul-1 and Skp2 with nasopharyngealcarcinoma and precancerous lesion

Skp2是DNA復制所必需的人類F-box蛋白家族中一員，在許多細胞周期相關蛋白的泛素依賴性蛋白水解途徑中起到特異性識別底物的作用, 從而參與細胞周期的調控[5～6]。Skp2 和Cul-1 所組裝的蛋白復合體稱為SCF（Skp1-Cul-1-F box protein），SCF復合物是泛素與蛋白底物結合所需的第三個酶，為泛素—蛋白酶體途徑的限速酶，參與許多細胞周期調控因子的泛素依賴性蛋白水解作用，它介導的泛素化降解途徑對細胞周期的調控起著重要作用，這種調控作用的失常常常與腫瘤的發生密切相關，而且，這一事件主要發生在該復合體的Cul-1亞基上，Cul-l蛋白在整個泛素連接酶復合物中起著一個類似模板的作用，其結構變化會引起SCF活性的變化，使許多底物蛋白降解水平發生改變。本實驗中，Cul-1在兩種類型鼻咽癌中的表達均高于癌前病變，證實Cul-1在鼻咽癌發生、發展過程中參與作用，而且是鼻咽上皮癌前病變發展成為鼻咽癌的質變過程中的重要參與因子，這一作用可能是持續的，不是體現在靜息期（G0期）到有絲分裂期（G1期）的轉換，而是重點參與了鼻咽上皮細胞G1期到G0期的轉變，Cul-l蛋白失去終止子活性，受到增生刺激的上皮細胞的有絲分裂無法正常停止，從而使細胞進入異常增生狀態，導致鼻咽上皮惡性腫瘤發生，可見Cul-l具有某種癌基因蛋白的性質，不過尚需要進一步的研究加以確定[7～10]。

Skp2在鼻咽癌中的表達明顯高于慢性鼻咽炎[11]，在本例研究中Skp2在鼻咽癌與癌前病變中的表達無顯著差異性，由此引出的推論：在鼻咽慢性炎癥轉變為癌前病變和癌的過程中，鼻咽上皮細胞從良性增生轉變為異型增生，細胞中Skp2蛋白的表達也發生了變化，Skp2可能參與了鼻咽癌的發生過程，它參與的細胞周期調節可能是鼻咽癌發生的早期事件。本例研究中沒有對Skp2在慢性鼻咽炎中的表達進行研究，因此以上推論還需要進一步驗證。

Cul-l作為細胞周期調控的上游因子，其變化必然導致一系列下游因子的轉變，從而全方位啟動細胞的惡性轉變，但是在本實驗中，Cul-l與Skp2在兩種類型鼻咽癌與癌前病變的相關性統計中顯示無差別，這一結果需要進一步驗證。

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The expression of Cullin-1 and Skp2 within nasopharygeal carcinoma and precancerous lesion

WANG Yun★, WANG Shuqin, ZHOU Xiaojun, WANG Jing, BI Chao, XUAN Ruixia, CHEN Yuwei, LU Jinwen, BAO Guixian
(Department of Pathology, Hospital of Tranditional Chinese Medicine of Zhongshan, Guangdong, Zhongshan 528400, China)

Objective To detect the expression of Cullin-1 (Cul-1) and S-phase kinase associated protein 2 (Skp2) in the tissues of nasopharyngeal carcinoma (NPC) and precancerous lesion, and elucidate the relationship between them. Methods Immunohistoehemical methods were taken to detect the expression of Cul-1 and Skp2 in the tissues taken before treatment among 20 differentiated carcinoma patients, 20 undifferentiated carcinoma patients, and 20 precancerous lesion patients. At last, the relationship between the expression of these protein was analyzed. Results The positive expression rates of Cul-1 in the tissues of differentiated carcinoma, undifferentiated carcinoma and precancerous lesion were 76%, 77% and 54%, respectively. The expression value were 1.63±0.7, 1.62±0.68, 1.15±0.64, respectively. The differences between differentiated carcinoma and precancerous lesion, undifferentiated carcinoma and precancerous lesion were statistically significant (P＜0.05). The positive expression rates of Skp2 in the tissues of differentiated carcinoma, undifferentiated carcinoma and precancerous lesion were 32%, 41%, 33%, respectively. The expression value were 0.53±0.49, 0.82±0.54, 0.72±0.43, and there were no difference between them. To analyze the expression of Cul-1 and Skp2 in 20 differentiated carcinoma, which had no significant correlation. Conclusion Cul-1 and Skp2 protein were involved in the occurrence and development of human nasopharyngeal carcinoma. And the Skp2 participated in cell cycle regulation that may be an early event of nasopharyngeal carcinoma. The relationship between Cul-1 and Skp2 in cell cycle regulation need further validation.

Nasopharyngeal carcinoma; Precancerous lesion; Cullin-1; Skp2

國家自然科學基金（81072847）；中山市衛生局醫學科研立項（J2011081）

中山市中醫院病理科，廣東，中山 528400

★通訊作者：汪蕓，E-mail:310355081@qq.com