利用改性載體固定化大腸桿菌產(chǎn)琥珀酸

梅佳軍，張常青，劉嶸明，馬江鋒，陳可泉，姜 岷

（南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211816）

琥珀酸又名丁二酸，是三羧酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，也是厭氧碳代謝過程的還原性終端產(chǎn)物。琥珀酸作為一種四碳二元羧酸，廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)、制造業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域[1]。利用細(xì)菌、真菌等各種微生物合成琥珀酸的生物法，原料來源廣泛，污染小，反應(yīng)溫和，成為近年來研究的熱點(diǎn)[2-3]。

目前，以棉纖維材料為吸附載體的固定化方法已經(jīng)廣泛用于有機(jī)酸[4-6]、酶制劑[7-8]、還原膠[9]等化學(xué)品的生產(chǎn)。棉纖維載體廉價(jià)易得，生物、化學(xué)及熱力學(xué)穩(wěn)定，相較于其它無機(jī)吸附材料如陶粒、木屑、秸稈等擁有更大的比表面積和孔隙率，傳質(zhì)效率更高[10-12]。通過對(duì)吸附材料的表面預(yù)處理，載體能提高吸附特異性，更多活力高的細(xì)胞富集到載體上，預(yù)處理后的載體吸附穩(wěn)定性更高，更適合長(zhǎng)期的固定化發(fā)酵[13-14]。聚乙烯亞胺（polyethyleneimine,PEI）是一種強(qiáng)堿性的高分子聚合物，聚合物分子鏈中含有多個(gè)陽(yáng)離子基團(tuán)，具有較高的電荷密度，能與纖維素中的的羥基反應(yīng)并交聯(lián)聚合，常被用于對(duì)細(xì)胞或載體的表面改性[15-16]。戊二醛（glutaraldehyde, GA）常用來做交聯(lián)劑，戊二醛中的醛基可以交聯(lián)聚乙烯亞胺中的氨基，經(jīng)常用于酶的固定化研究，同時(shí)能與微生物細(xì)胞膜的磷脂雙分子層中的蛋白質(zhì)相互作用。眾多實(shí)驗(yàn)表明用聚乙烯亞胺和戊二醛化學(xué)處理后的棉纖維載體，表面正電荷量、表面粗糙度、攜帶的活性基團(tuán)數(shù)等[17-18]均有所提高，增加了載體細(xì)胞負(fù)載量和吸附強(qiáng)度。

本工作用聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）和戊二醛（glutaraldehyde, GA）對(duì)棉纖維載體進(jìn)行預(yù)處理，提高載體對(duì)菌體的吸附作用，考察其對(duì)丁二酸生產(chǎn)菌株Escherichia coliAFP111 [F+ λrpoS396(Am)rph-1△(pflAB::Cam)ldhA::Kan 95ptsG]細(xì)胞固定效率及發(fā)酵性能的影響，在此基礎(chǔ)上，對(duì)改性材料固載的細(xì)胞進(jìn)行7次重復(fù)批式發(fā)酵，探討了材料吸附和固定化發(fā)酵的穩(wěn)定性，為下一步研究和放大培養(yǎng)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

菌 種 ：Escherichia coliAFP111 [F+λrpoS396(Am)rph-1△(pflAB::Cam)ldhA::Kan 95ptsG]，由 David P.Clark 教授（Southern Illinois University）惠贈(zèng)。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g/L，酵母浸粉 5 g/L，NaCl 5 g/L，pH值7.0，卡那霉素30 mg/L，氯霉素30 mg/L，過濾除菌后加入。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g/L，酵母浸粉5 g/L，NaCl 5 g/L，pH值7.0，葡萄糖43 g/L，堿式碳酸鎂33.6 g/L。其中，研究“不同PEI-GA改性棉纖維添加量對(duì)固定化批次發(fā)酵丁二酸的影響”時(shí)葡萄糖濃度為21 g/L，“不同初始葡萄糖濃度對(duì)固定化批次發(fā)酵丁二酸的影響”時(shí)，葡萄糖濃度分別選擇 19 g/L、30 g/L、39 g/L、47 g/L、59 g/L，相應(yīng)堿式碳酸鎂和糖的比例按4∶5添加，卡那霉素30 mg/L，氯霉素30 mg/L。

1.2 材 料

載體的原材料為市售純白棉布（厚 1 mm，孔隙率＞95%，密度 0.25 g/cm，比表面積＞40 m2/m3），裁剪為1 cm×1 cm，純水洗凈烘干備用。

1.3 方 法

1.3.1 棉纖維的預(yù)處理

使用PEI修飾上述洗凈烘干后的棉纖維載體，放置于2 g/L的 PEI 水溶液中浸泡 2 h，用 HCl 調(diào)整溶液 pH值至 7.0，在去離子水中充分漂洗，烘干，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

再使用 GA交聯(lián)處理經(jīng) PEI 化學(xué)修飾的棉纖維織物，在含GA 10 g/L 的 0.05 mol/L 磷酸鉀緩沖溶液中（pH 值7.0）浸泡 2 h，在去離子水中充分漂洗，烘干，4 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 靜態(tài)吸附試驗(yàn)

收集處于穩(wěn)定生長(zhǎng)時(shí)期的菌體細(xì)胞，離心（12000 r/min，10 min，4 ℃），用 0.5 mol/L 磷酸鉀緩沖溶液（pH值 7.0）洗滌兩次，再次懸浮于上述磷酸鉀緩沖溶液中，初始OD600值為6.19。裁成小方塊的棉纖維織物按100 g/L放入含50 mL菌懸液的厭氧血清瓶?jī)?nèi)，置于搖床中，轉(zhuǎn)速控制在 150 r/min，溫度為 37 ℃。菌體吸附4 h，直至菌懸液中的OD600值不再降低。

1.3.3 種子培養(yǎng)

將保存于－80 ℃凍存管中的菌株以1%的接種量轉(zhuǎn)接到裝液量為5 mL的試管中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h作為一級(jí)種子。將試管中的一級(jí)種子，以1%的接種量轉(zhuǎn)接到裝液量為100 mL 的500 mL 三角瓶中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)6 h，作為二級(jí)種子。

1.3.4 搖瓶發(fā)酵

將二級(jí)種子液以10%的接種量轉(zhuǎn)接到裝液量為50 mL的厭氧血清瓶中，通無菌CO22 min以維持厭氧環(huán)境，37℃、200 r/min 培養(yǎng)。固定化細(xì)胞的重復(fù)批式發(fā)酵是指在培養(yǎng)基中加入無機(jī)載體，當(dāng)發(fā)酵結(jié)束后，去掉發(fā)酵液，然后加入新鮮的培養(yǎng)液再次進(jìn)行發(fā)酵，其培養(yǎng)基組成同前所述。

1.3.5 分析檢測(cè)

菌體密度測(cè)定：紫外可見分光光度、（Spectrumlab 752 S），于600 nm處測(cè)定吸光值。

葡萄糖濃度測(cè)定：生物傳感分析儀（SBA240C，山東省科學(xué)院生物研究所）。

發(fā)酵液中有機(jī)酸的測(cè)定：用高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)，色譜柱為Prevail Organic Acid，流動(dòng)相為25 mmol/L KH2PO4，pH值 2.5，流速1.0 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm，丁二酸出峰時(shí)間為9.9 min, 乙酸出峰時(shí)間為6.2 min。

靜態(tài)細(xì)胞吸附效率計(jì)算方法：

式中，A1為吸附開始時(shí)游離細(xì)胞濃度，以該濃度下的吸光度OD600表示；A2為吸附結(jié)束時(shí)游離細(xì)胞濃度，以該濃度下吸光度OD600表示；η為細(xì)胞吸附效率。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料預(yù)處理對(duì)靜態(tài)吸附效果的影響

天然的纖維質(zhì)材料由于和微生物細(xì)胞的表面特性相近，一定程度上阻礙了菌體細(xì)胞的吸附過程。因此，采用PEI和GA對(duì)棉纖維織物進(jìn)行化學(xué)修飾。本實(shí)驗(yàn)探討了化學(xué)改性前后載體靜態(tài)吸附情況，結(jié)果如圖1所示。

圖1 材料預(yù)處理對(duì)靜態(tài)吸附效果的影響

圖1結(jié)果表明，4 h后未處理和改性過的棉纖維載體細(xì)胞吸附率分別為 53.3%和 87.1%，預(yù)處理后載體負(fù)載量提高了 63.3%，證明該預(yù)處理方法能有效提高了載體的吸附性能。

2.2 初始葡萄糖濃度對(duì)固定化批次發(fā)酵丁二酸的影響

PEI-GA棉纖維載體的添加量為100 g/L，培養(yǎng)基中分別添加19g/L、30g/L、39g/L、47g/L、59 g/L的葡萄糖，厭氧發(fā)酵結(jié)束，測(cè)定丁二酸、乙酸產(chǎn)量和生物量，結(jié)果見圖2。

由圖2可見，隨著葡萄糖濃度的提高，丁二酸的終濃度也增加，但轉(zhuǎn)化率下降，游離細(xì)胞濃度也隨之升高，高濃度的葡萄糖不利于細(xì)胞的吸附。當(dāng)葡萄糖的濃度高于47 g/L，丁二酸產(chǎn)量不再增加，且轉(zhuǎn)化率下降明顯，乙酸量明顯增加，發(fā)酵體系中游離細(xì)胞占多數(shù)。因此，控制發(fā)酵初始葡萄糖的濃度低于47 g/L有利于細(xì)胞的固定化發(fā)酵。

圖2 初始葡萄糖濃度對(duì)固定化批次發(fā)酵丁二酸的影響（丁二酸收率=生成丁二酸的質(zhì)量/消耗底物葡萄糖的質(zhì)量）

2.3 PEI-GA改性棉纖維添加量對(duì)固定化批次發(fā)酵丁二酸的影響

將PEI-GA棉纖維按照80～180 g/L的添加量加入發(fā)酵培養(yǎng)基，厭氧發(fā)酵48 h，結(jié)果見圖3。

由圖3可見，當(dāng)PEI-GA棉纖維添加量從80 g/L增加到120 g/L，游離細(xì)胞濃度由OD600從2.0降至1.6，丁二酸產(chǎn)量由12.72 g/L增至14.78 g/L，轉(zhuǎn)化率從60.6%提高到70.3%，隨著載體添加量的繼續(xù)增加，雖然游離細(xì)胞量繼續(xù)下降，但丁二酸產(chǎn)量明顯下降且乙酸量增加，原因在于反應(yīng)體積有限，而載體加入量過多，導(dǎo)致傳質(zhì)效果不好，影響丁二酸產(chǎn)量，因此確定PEI-GA棉纖維最佳添加量為120g/L。

2.4 PEI-GA棉纖維與未改性載體固定化批次發(fā)酵的對(duì)比

根據(jù)上述優(yōu)化過的條件，進(jìn)行改性前后發(fā)酵對(duì)比實(shí)驗(yàn)，載體添加量為120 g/L,初糖濃度控制在43 g/L,厭氧發(fā)酵結(jié)束，測(cè)定丁二酸產(chǎn)量、乙酸產(chǎn)量、丁二酸轉(zhuǎn)化率和生物量，結(jié)果見表1。

圖3 不同PEI-GA改性棉纖維添加量對(duì)固定化批次發(fā)酵丁二酸的影響

表1 PEI-GA棉纖維與未改性載體固定化批次發(fā)酵的對(duì)比

由表1可見，發(fā)酵終止時(shí)，與添加未處理載體相比，PEI-GA棉纖維載體發(fā)酵液中游離細(xì)胞濃度OD600由3.5降至1.8，丁二酸產(chǎn)量提高了11.3%，乙酸產(chǎn)量降低了29.8%，丁二酸轉(zhuǎn)化率提高了7.5%?？梢娸d體改性對(duì)菌的生產(chǎn)性能有一定程度的提高，有利于固定化大腸桿菌生產(chǎn)丁二酸。

2.5 PEI-GA棉纖維固定化重復(fù)化批次發(fā)酵產(chǎn)丁二酸

通過重復(fù)批次發(fā)酵實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證改性載體在固定化發(fā)酵產(chǎn)丁二酸中的重復(fù)穩(wěn)定性，載體添加量為120 g/L，初糖濃度控制在43 g/L左右，對(duì)固定化大腸桿菌進(jìn)行了重復(fù) 7批次發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，每批次發(fā)酵結(jié)束，記錄所產(chǎn)丁二酸、乙酸、游離細(xì)胞濃度，生產(chǎn)速率和轉(zhuǎn)化率，結(jié)果如圖4 、圖5所示。

由圖4、圖5可知，7批重復(fù)固定化發(fā)酵丁二酸產(chǎn)量穩(wěn)定維持在 27.4 g/L以上并且沒有下降趨勢(shì)，前3批發(fā)酵完成后，大腸桿菌在固定化材料上生長(zhǎng)達(dá)到平衡，生產(chǎn)效率和轉(zhuǎn)化率分別維持在0.657 g/(L·h) 和 70.42%以上，乙酸產(chǎn)量和游離細(xì)胞濃度略有下降。綜上所述，在重復(fù)分批次發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，丁二酸產(chǎn)量、生產(chǎn)效率和轉(zhuǎn)化率在經(jīng)過7批發(fā)酵后仍保持較高水平，吸附于改性載體上的菌體活力無明顯下降，載體上一直保持較高的活細(xì)胞比例[19-21]，載體有較好重復(fù)穩(wěn)定性。

圖4 PEI-GA棉纖維固定化重復(fù)化批次發(fā)酵產(chǎn)丁二酸

圖5 不同批次生產(chǎn)效率和轉(zhuǎn)化率

2.6 發(fā)酵前后材料掃描電鏡觀察

利用 SEM 對(duì)材料改性前后的表面和發(fā)酵結(jié)束后固定化細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6。

從掃描電鏡圖6（a）、（b）中發(fā)現(xiàn)，未處理棉纖維織物表面相對(duì)光滑，而經(jīng)過PEI-GA處理后，纖維表面連接上了很多聚乙烯亞胺多聚體，褶皺增多，表面粗糙度提高，增加與菌體的接觸面積，從而增加載體的負(fù)載量[22-23]。圖 6（c）為未處理載體固定化發(fā)酵結(jié)束菌體在載體上的固定形態(tài)，菌體分布稀疏，固定于載體的細(xì)胞較少，而圖 6（d）中在連接有聚乙烯亞胺多聚體的部位富集有大量菌體，該現(xiàn)象符合2.4節(jié)中測(cè)得的發(fā)酵體系最終游離細(xì)胞濃度結(jié)果。

圖6 改性前后載體和發(fā)酵結(jié)束固定化細(xì)胞掃描電鏡圖

3 結(jié) 論

本工作考察了用聚乙烯亞胺（PEI）和戊二醛（GA）改性前后載體靜態(tài)吸附情況，經(jīng)過化學(xué)改性后，棉纖維載體的負(fù)載量得到顯著提高，表明 PEI和GA改性對(duì)提高載體與細(xì)胞之間的相互作用是一種行之有效的方法。

由于真實(shí)發(fā)酵環(huán)境比較復(fù)雜，培養(yǎng)基組成對(duì)細(xì)胞吸附行為有很大的影響，本文重點(diǎn)考察了初始葡萄糖濃度對(duì)固定化發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響。結(jié)果表明隨著葡萄糖初始濃度的增加，發(fā)酵體系中游離細(xì)胞濃度也隨之增加，與Bar等[24]的報(bào)道一致，丁二酸的轉(zhuǎn)化率降低，乙酸的產(chǎn)率增加，產(chǎn)物分布的改變，原因可能是代謝途徑中的關(guān)鍵酶受到抑制使代謝途徑改變生成其它物質(zhì)[25-26]，比如乙酸。改性載體添加量增加有利于細(xì)胞的吸附，但是發(fā)酵體系有限，添加過多的載體反而不利于傳質(zhì)，導(dǎo)致丁二酸轉(zhuǎn)化率下降，副產(chǎn)物增多。

在重復(fù)批次固定化發(fā)酵過程中，第三批之后，隨著菌體生長(zhǎng)達(dá)到平衡，丁二酸產(chǎn)量、產(chǎn)率等均有小幅上升，原因可能是吸附于載體上的菌體與載體之間不再只有單純的物理吸附，已經(jīng)發(fā)生生物吸附，從電鏡圖可以直觀地看出，改性載體表面連接有聚乙烯亞胺多聚體的部位聚集有大量菌體，形成菌膜，菌體局部密度更大，更能適應(yīng)發(fā)酵體系。重復(fù)7批次的過程中，丁二酸的最終濃度、生產(chǎn)效率和轉(zhuǎn)化率無下降趨勢(shì)，體現(xiàn)了棉纖維織物等纖維材料作為載體的優(yōu)點(diǎn)，固定化細(xì)胞可以不斷更新，固定化載體上一直保持較高的活細(xì)胞比例。

本工作主要考察了以PEI和GA化學(xué)修飾棉纖維為載體的丁二酸固定化發(fā)酵，與改性載體固定化發(fā)酵相比，丁二酸產(chǎn)量、生產(chǎn)效率和轉(zhuǎn)化率均有所提高。7批次重復(fù)發(fā)酵過程中，生產(chǎn)效率無下降趨勢(shì)，有較好的重復(fù)穩(wěn)定性。

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