利用Clostridium saccharobutylicum DSM 13864 連續發酵生產丁醇

夏子義，倪 曄，孫志浩，王 云，吳香玉

（江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江南大學生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

近年來，隨著原油價格的不斷上漲和石化燃料生產和使用中所引起的環境問題的加劇，發酵法生產新型生物燃料得到了廣泛關注[1]。丁醇作為一種四碳平臺化合物，被廣泛用作溶劑和有機合成化學工業的原料。另外，與傳統的生物燃料乙醇相比，丁醇具有與汽油相當的熱值和辛烷值、較低的腐蝕性和揮發性、能與汽油以任意比混合等優點[2]。因此，丁醇被認為是一種極具潛力的新型生物燃料。

丁醇可以通過化學合成和厭氧發酵兩種方式生產。發酵法生產丁醇可以追溯到第一次世界大戰期間，采用的操作方式多為分批發酵，其規模曾僅次于燃料乙醇發酵[3]。到20世紀中期，由于廉價的石化法的出現，發酵法生產丁醇逐漸被淘汰[4]，但是我國、前蘇聯等國家仍繼續采用發酵法，并進行工藝改進使用連續發酵法生產丁醇[5]。傳統的分批發酵法生產丙酮丁醇存在產物對菌體有毒害、溶劑總濃度低、生產率和得率低等缺點[6]，其生產率僅有0.1～0.3 g/(L·h)[7]。另外，丁醇本身的毒性也會降低其生產率。這些問題能通過菌種改造[8-9]或者使用連續發酵與下游產物提取技術相結合[10]的操作方法來解決。連續發酵通過不斷地補加新鮮的培養基同時排出等量的發酵醪液來使菌體處于穩定的生長狀態，與其它的發酵方式相比可以縮短發酵周期提高設備利用率，降低溶劑對菌體的毒害作用，提高溶劑的生產率[11]。2006年Liew等[12]以西米淀粉為原料進行單級連續發酵產丁醇的研究表明在稀釋率為0.1 h?1和pH值控制在4.5的條件下可以獲得0.85 g/(L·h)的生產率，為分批發酵的1.5倍。2011年Malaviya等[13]采用化學誘變得到菌株Clostridium pasteurianumMBEL_GLY2，以甘油為主要的碳源進行細胞循環連續發酵，稀釋率0.9 h?1時丁醇和總溶劑的生產率分別為 8.3 g/(L·h)和7.8 g/(L·h)。2011 年 Richter 等[14]以Clostridium saccharoperbutylacetonicumN1-4為發酵菌種，丁酸和葡萄糖為底物，采用耦合氣提兩級連續發酵的操作方式，在0.025 h?1的稀釋率下獲得了15.7 g/L的總溶劑，丁醇的生產率為0.39 g/(L·h)。

本研究以Clostridium saccharobutylicumDSM 13864為發酵菌株，葡萄糖為碳源進行四級連續發酵，考察了稀釋率和溫度對丁醇生產的影響。通過以葡萄糖培養基進行四級連續發酵的研究，旨在提高溶劑的生產率和獲得一種能長時間穩定操作的連續發酵模式，為使用廉價糖質原料（如糖蜜、秸稈水解液等）進行連續發酵生產丙酮丁醇的工業化提供理論依據和實驗指導。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗菌種

Clostridium saccharobutylicumDSM 13864 購自德國微生物菌種保藏中心（DSMZ）。

1.2 培養基

種子培養基（RCM培養基）：酵母膏3 g/L，牛肉膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，可溶性淀粉1 g/L，葡萄糖5 g/L，半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L，NaCl 3 g/L，NaAc 3 g/L，刃天青 3 mg/L，pH 值6.5，115 ℃ 滅菌20 min。

發酵培養基：葡萄糖 60 g/L，玉米漿干粉 10 g/L，CaCO34.0 g/L，(NH4)2SO42 g/L，K2HPO40.5 g/L，MnSO4·H2O 0.01 g/L，pH 值 6.0，115 ℃ 滅菌20 min。

1.3 實驗方法

種子培養：室溫保藏的菌種孢子懸液以10%的接種量轉接于RCM培養基中，37 ℃厭氧培養12～18 h。

分批發酵：將種子液按8%的接種量，接種到3 L發酵罐的發酵培養基中，裝液量1.5 L，37 ℃條件下發酵66 h。

連續發酵：連續發酵在3 L發酵罐中進行，采用四級連續發酵，每級罐的工作體積維持在1 L，4個罐分別命名為一級罐（Ⅰ）、二級罐（Ⅱ）、三級罐（Ⅲ）和四級罐（Ⅳ）。連續發酵前，一級和二級罐裝有 1L發酵培養基，三級和四級為空罐，在一級和二級接種并進行16～18 h的分批發酵后，開始以一定的速率向一級罐中補加新鮮的發酵培養基，同時二級罐中的發酵液以相同的速率流入到三級罐中，待三級罐積累到1 L后開始流入四級罐，各級罐的發酵體積通過蠕動泵控制在1 L。考察稀釋率（D）對連續發酵的影響時，4個罐的溫度都控制在37 ℃，轉速為50 r/min，稀釋率分別為0.03 h?1、0.05 h?1和0.1 h?1。考察溫度對連續發酵的影響時，稀釋率為0.05 h?1，轉速為50 r/min，一級和二級罐維持恒溫 37 ℃，三級和四級罐的溫度相同，分別控制在30 ℃、33 ℃和37 ℃。整個連續發酵過程中無pH值的調控，每隔一定時間取樣分析。

1.4 測定方法

菌體濃度：發酵液用1.8%的稀鹽酸稀釋一定倍數后，在600 nm處測定其吸光值，然后代入菌體濃度標準曲線y=1.076x－0.001（R2=0.999），x為OD600，y為菌體濃度。

糖含量：葡萄糖濃度使用SBA-40C生物傳感分析儀（山東省科學院生物研究所）測定。

相關參數的計算方法：得率=總溶劑/總糖消耗；生產率=總溶劑/總停留時間；停留時間=1/稀釋率。

溶劑和有機酸：溶劑（丙酮、乙醇、丁醇）和有機酸（乙酸、丁酸）的測定采用氣相色譜法（GC）。毛細管色譜柱：PEG-20M（30 m×0.32 mm×0.5μm）。柱溫條件：初始60 ℃，保持0.5 min后，以10 ℃/min的速度升至120 ℃，保持0.5 min后，以15 ℃/min的速度升至150 ℃，保持0.5 min后，以20 ℃/min的速度升至190 ℃，保持1 min。進樣口溫度180 ℃，FID檢測器溫度210 ℃，進樣量1.0 μL，分流比90∶1。尾吹流速29 mL/min，氫氣流速30 mL/min，空氣流速300 mL/min。

2 結果與分析

2.1 3 L發酵罐中的分批發酵

為了給連續發酵提供一定的實驗依據，首先考察了C.saccharobutylicumDSM 13864以葡萄糖為底物分批發酵生產丁醇過程中的各重要參數（菌體濃度、pH值、殘糖、溶劑和有機酸）的變化情況，其結果如圖 1所示。從圖1中可以看出：隨著發酵的進行，葡萄糖不斷地被消耗，在28 h左右葡萄糖濃度已經低于3 g/L，發酵的最終殘留葡萄糖平均濃度為2.05 g/L。伴隨著葡萄糖的不斷消耗菌體濃度逐漸上升，到 28 h時菌體濃度達到最大值為 7.19 g/L。在發酵前期，葡萄糖被菌體利用首先產生乙酸和丁酸，兩種酸的積累使發酵液的pH值不斷下降；當pH值下降到4.91時，菌體所處的環境不再適合其生長，此時菌體將乙酸和丁酸進一步還原為其相應的乙醇和丁醇，以緩解低pH值對其生長的影響。發酵結束后乙酸和丁酸的殘留量分別為1.68 g/L和0.69 g/L。分批發酵16 h后，溶劑的量迅速地上升，在48 h時，總溶劑的濃度達到最高值18.20 g/L，其中丙酮5.29 g/L、乙醇1.38 g/L、丁醇11.53 g/L，生產率為0.379 g/(L·h)，總溶劑得率為0.314 g/g。

2.2 不同稀釋率對連續發酵的影響

圖1 C.saccharobutylicum DSM 13864分批發酵時間進程

圖2 不同稀釋率對C.saccharobutylicum DSM 13864四級連續發酵pH、菌體濃度和殘糖的影響

圖3 不同稀釋率對C.saccharobutylicum DSM 13864四級連續發酵總溶劑產量的影響

圖4 不同稀釋率對C.saccharobutylicum DSM 13864四級連續發酵總酸產量的影響

表1 不同稀釋率下C.saccharobutylicum DSM 13864四級連續發酵的參數

在連續發酵過程中，底物的補加速率會顯著影響菌體的生長和溶劑的生產，因此稀釋率是連續發酵的一個重要的影響因素[15]。稀釋率越高，則底物在罐中的停留時間越短，營養物質與細胞的接觸時間越少，從而底物的利用率較低；稀釋率越低，則原料在罐中的停留時間越長，底物的利用率越高，但生產率將降低[16]。本研究采用下進上出的四級連續發酵方式，考察了3個不同稀釋率0.03 h?1、0.05 h?1和0.1 h?1對連續發酵中各重要參數的影響，結果如圖 2～圖 4，各個稀釋率下一級罐和四級罐的發酵數據顯示在表 1中。在3個不同稀釋率下，一級罐（Ⅰ）的菌體濃度波動較大，3個稀釋率（0.03 h?1、0.05 h?1和0.1 h?1）條件下的一級罐的平均菌體濃度分別為2.19 g/L 、3.10 g/L和4.84 g/L；四級罐的平均菌體濃度分別為1.02 g/L、1.34 g/L和2.13 g/L，表明高稀釋率（0.1 h?1）有利于菌體的生長。然而高稀釋率（0.1 h?1）下的末級罐流出液中的殘留葡萄糖濃度較高，與稀釋率0.03 h?1（總溶劑得率0.208 g/g）和0.05 h?1（總溶劑得率0.248 g/g）相比，其總溶劑得率僅為0.255 g/g。稀釋率對連續發酵產溶劑的影響如圖 3所示，當稀釋率為0.05 h?1時，一級罐（Ⅰ）在連續發酵100 h后溶劑產量趨于穩定，其總溶劑平均產量為9.14 g/L（丁醇為5.96 g/L），生產率為0.457 g/(L·h)，是分批發酵[0.379 g/(L·h)]的1.21倍；而此稀釋率下四級罐（Ⅳ）流出液中總溶劑最高為11.57 g/L（其中丁醇7.29 g/L），四級發酵罐的總生產率僅為0.145 g/(L·h)。當稀釋率為0.1 h?1時，一級罐的平均總溶劑產量為8.20 g/L（丁醇為5.56 g/L），四級罐（Ⅳ）流出液中的平均總溶劑產量為8.99 g/L（丁醇為6.14 g/L），其一級罐生產率和四級發酵罐的總生產率分別為 0.820 g/(L·h)和0.225 g/(L·h)。有文獻報道[17]在稀釋率為 0.3 h?1下總溶劑的生產率能達到2 g/(L·h)，但是其總溶劑的產量卻低于8 g/L，這顯然不利于溶劑的下游分離提取。在連續發酵進行456 h后將稀釋率下調至0.03 h?1，但其總溶劑產量與另外兩個稀釋率相比較低，這可能是由于太低稀釋率的條件下葡萄糖的補加速率無法完全滿足菌體進入有利于溶劑生產所需要的培養基環境中。從圖 4中可以看出，0.1 h?1與0.03 h?1的稀釋率相比兩種酸的積累量相差不明顯，可能是由于稀釋率從0.1 h?1降到0.03 h?1后發酵罐中殘留的酸不能及時地被轉化為溶劑，且不能很快地流出發酵罐，從而使得兩個稀釋率下的酸積累量相近；而與 0.05 h?1的稀釋率相比兩種酸的累積量卻明顯升高，相比之下高稀釋率的確有利于酸的累積。在稀釋率為0.1 h?1時其四級罐中平均總酸為5.44 g/L，其中乙酸3.36 g/L，丁酸2.08 g/L。

2.3 不同溫度對連續發酵的影響

Glassner等[18]報道，在多級連續發酵進入產溶劑期后降低發酵溫度，有助于提高丁醇和總溶劑的產量。表2顯示了稀釋率為0.05 h?1下的不同溫度連續發酵的結果，結合之前關于溫度對C.saccharobutylicumDSM 13864菌體生長和丁醇生產的影響結果（數據未顯示）[19],其溫度控制為：一級和二級罐溫度恒定在 37 ℃，三級和四級罐的溫度相同并分別控制在30 ℃、33 ℃和37 ℃。一級、二級罐溫度控制在37℃主要是為了獲得生長旺盛的種子發酵液，而三級和四級主要用于考察不同溫度對溶劑積累的影響。表2列出了3種溫度條件下四級罐流出液中的各重要發酵參數。當三級和四級罐的溫度控制在 33 ℃時，總溶劑的產量為最高（13.69 g/L），其中丁醇產量為8.36 g/L。而在 30 ℃和 37 ℃條件下，總溶劑的產量相差不明顯（11.39 g/L和11.57 g/L）。而對于酸的積累，隨溫度的升高總酸的積累量呈逐漸下降趨勢。在33 ℃條件下，溶劑得率（0.271 g/g）和生產率[0.171 g/(L·h)]均為最高水平，殘留葡萄糖濃度最低（9.57 g/L）。

表2 D=0.05 h?1時不同溫度控制下的連續發酵參數

3 結 論

本文以葡萄糖培養基進行了四級連續發酵的初步研究，通過建立和優化連續發酵工藝為以后使用廉價糖質原料（如糖蜜、秸稈水解液等）進行連續發酵提供理論依據和實驗基礎，得出以下主要結論。

（1）與分批發酵相比，連續發酵一級罐中能獲得較高的溶劑生產率。在連續發酵研究中，丁醇的產量受稀釋率的影響較大，隨著稀釋率的增加，四級罐流出液中的溶劑濃度呈現下降趨勢，而菌體濃度逐漸升高。

（2）稀釋率為 0.05 h?1時，其總溶劑產量最高（11.57 g/L，其中丁醇7.29 g/L），一級罐的生產率為 0.457 g/(L·h)，是分批發酵[0.379 g/(L·h)]的 1.21倍，其總生產率為0.145 g/(L·h)。

（3）在0.05 h?1稀釋率下的變溫連續發酵表明低溫有利于溶劑的積累，當一級和二級罐溫度控制在37 ℃，三級和四級罐溫度控制在33 ℃時，總溶劑的產量最高（13.69 g/L，其中丁醇為8.36 g/L），生產率為 0.171 g/(L·h)。

[1]Qureshi N，Saha B C，Dien B，et al.Production of butanol (a biofuel)from agricultural residues：Part Ⅰ-Use of barley straw hydrolysate[J].Biomass Bioenergy，2010，34（4）：559-565.

[2]楊明，劉力強，牛昆，等.丙酮丁醇發酵菌的分子遺傳改造[J].中國生物工程雜志，2009，29（10）：109-114.

[3]陳騊聲，陸祖祺.發酵法丙酮和丁醇生產技術[M].北京：化學工業出版社，1991：15-16.

[4]Yu Y，Tangney M，Aass H C，et al.Analysis of the mechanism and regulation of lactose transport and metabolism inClostridiumacetobutylicumATCC 824[J].Applied and Environmental Microbiology，2007，73（6）：1842-1850.

[5]Ni Y，Sun Z H.Recent progress on industrial fermentative production of acetone-butanol-ethanol byClostridium acetobutylicumin China[J].Applied Microbiology Biotechnology，2009，83（3）：415-423.

[6]靳孝慶，王桂蘭，何冰芳.丙酮丁醇發酵的研究進展及其高產策略[J].化工進展，2007，26（12）：1727-1732.

[7]Zhang Y，Ma Y，Yang F X，et al.Continuous acetone-butanol-ethanol production by corn stalk immobilized cells[J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology，2009，36（8）：1117-1121.

[8]Lütke E T ， Bahl H.Metabolic engineering ofClostridium acetobutylicum：Recent advances to improve butanol production[J].Current Opinion in Biotechnology， 2011，22（5）：634-647.

[9]顧陽，蔣宇，吳輝，等.生物丁醇制造技術現狀和展望[J].生物工程學報，2010，26（7）：914-923.

[10]焦瑞身，鄭幼霞，沈永強，等.丙酮丁醇連續發酵的研究[J].微生物學報，1964，10（2）：137-147.

[11]Mutschlechner O，Swoboda H，Gapes J R.Continuous two-stage ABE-fermentation usingClostridium beijerinckiiNRRLB592 operating with a growth rate in the first stage vessel close to its maximal value[J].JournalofMolecularMicrobiology Biotechnology，2000，2（1）：101-105.

[12]Liew S，Arbakariya A，Rosfarizan M，et al.Production of solvent(acetone-butanol-ethanol) in continuous fermentation byClostridium saccharobutylicumDSM 13864 using gelatinised sago starch as a carbon source[J].Malaysian Journal of Microbiology，2006，2（2）：42-50.

[13]Malaviya A，Jang Y S，Lee S Y，et al.Continuous butanol production with reduced byproducts formation from glycerol by a hyper producing mutant ofClostridium pasteurianum[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2011，93（4）：1485-1494.

[14]Richter H，Qureshi N，Heger S，et al.Prolonged conversion ofn-butyrate ton-butanol withClostridium saccharoperbutylacetonicumin a two-stage continuous culture with in-itu product removal[J].Biotechnology and Bioengineering，2011，109（4）：913-921.

[15]Yen H W，Li R J.The effects of dilution rate and glucose concentration on continuous acetone-butanol-ethanol fermentation byClostridium acetobutylicumimmobilized on bricks[J].Journal of Chemical Technology and Biotechnology，2011，86（11）：1399-1404.

[16]范力敏，翁正元，陳曉湘，等.固定化細胞連續生產丙酮丁醇的研究[J].上海交通大學學報，1993，27（6）：116-120.

[17]Qureshi N，Schripsema J，Lienhardt J，et al.Continuous solvent production byClostridium beijerickiiBA101 immobilized by adsorption onto brick[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2000，16（4）：377-382.

[18]Glassner D A，Mahendra K J，Rathin D.Process for the fermentative production of acetone, butanol and ethanol：US，5063156[P].1991-11-05.

[19]Ni Y，Wang Y，Sun Z H, et al.Butanol production from cane molasses byClostridium saccharobutylicumDSM 13864：Batch and semi-continuous fermentation[J].AppliedBiochemistry and Biotechnology，2012，166（8）：1896-1907.