五碳糖和六碳糖共發酵生產酒精菌株選育的研究進展

張 強，冀 偉，王一東

（長春理工大學生命科學技術學院，吉林 長春 130022）

纖維質原料是地球上最豐富的可再生資源，主要由纖維素、半纖維素和木質素構成。我國每年可利用的纖維質原料大約在7×108t，主要來自農業、林業、工業以及城市的廢棄物，這些都是酒精生產的豐富原料。 隨著世界能源危機日趨惡化，利用成本低廉的纖維質原料發酵生產燃料酒精已經引起人們極大的興趣[1]。

盡管纖維質原料來源廣泛、成本廉價，但將其生物轉化成酒精的工藝過程非常復雜。目前整體水平尚處于中試階段，主要由于原料預處理、纖維素酶解、水解物發酵三大關鍵技術尚未取得工業化突破。有關纖維質原料制取酒精的預處理技術、酶解技術目前論述較多，為纖維質原料酒精生產提供了新的研究思路。因此本文主要對另一關鍵技術——利用五碳糖和六碳糖共發酵生產酒精菌種選育進行探討。

纖維素水解主要產物是葡萄糖等六碳糖，而半纖維素水解產物主要是木糖等五碳糖。傳統用于酒精發酵的微生物，例如釀酒酵母能很容易地利用葡萄糖進行酒精發酵，但不能利用木糖。充分利用纖維質原料中的木糖，可使酒精的產量在原有基礎上增加25%[2-3]。因此選育能共發酵五碳糖和六碳糖生產酒精的菌株，對于實現纖維質原料酒精工業化生產具有重要的意義。

本文主要介紹了利用自然微生物、重組運動發酵單胞菌、重組大腸桿菌以及重組釀酒酵母等進行五碳糖和六碳糖酒精發酵的進展情況。

1 自然微生物

過去人們一直認為木糖不能用于酒精發酵。直到1980年科學家發現，一些細菌、酵母菌等可通過發酵木糖生產酒精，目前已經發現有一百多種微生物能夠代謝木糖。國內外研究最多的就是酵母菌，主要包括樹干畢赤酵母（Pichia stipitis）、嗜鞣管囊酵母（Pachysolen tannop hilus）、休哈塔假絲酵母（Candida shehatae）和產朊假絲酵母等，它們既能夠利用葡萄糖也能利用木糖進行酒精發酵。湯斌等[4]經過篩選獲得一株休哈塔假絲酵母TZ8-13，然后利用木糖和葡萄糖進行發酵，當糖濃度為60 g/L時，酒精產量分別達到21.6 g/L和24.2 g/L。但人們目前研究最多、最深入且最具有工業應用價值的仍是樹干畢赤酵母。

Agbogbo等[5]首先采用樹干畢赤酵母（P.stipitisCBS 6054）對葡萄糖和木糖混合物（60g/L）進行了詳細酒精發酵研究，見表 1。試驗結果表明，菌體對葡萄糖利用優先于木糖，葡萄糖大部分用于細胞生長，而木糖主要用于酒精合成。因此雖然葡萄糖的消耗率較高，但酒精得率相對較低；而木糖雖然消耗率較低，但酒精得率相對較高。所以從表 1中看到隨著混合物中木糖比例增高，酒精得率也明顯增高。

后來Agbogob又采用上述菌種作為發酵菌種，將玉米秸稈經過稀硫酸處理后，利用過濾后的水解液進行酒精發酵，其中每升水解液中含34 g木糖及8 g葡萄糖，經過72 h發酵，最高酒精得率達到了0.44g/g[6]。Ferrari等[7]利用稀硫酸處理的桉木水解液，采用樹干畢赤酵母（Pichia stipitisNRRLY- 7124.）作為發酵菌種，在氧傳遞速率 2.4 mmol/ (L·h)，pH值6.5情況下，經過75 h發酵，酒精得率為0.35g/g。

表1 樹干畢赤酵母發酵葡萄糖和木糖混合物發酵結果

雖然樹干畢赤酵母能夠利用五碳糖和六碳糖，但對酒精和抑制劑耐受度低，導致發酵液中酒精濃度低，而且發酵過程中需要“半好氧”，限制了其在工業生產中的應用。脫毒處理往往會取得更好的結果。作者利用濕熱預處理（195 ℃，15 min）后的玉米秸稈水解液，分別采用中和法、飽和生石灰法和 Na2SO3法去除水解液中的抑制劑，然后利用樹干畢赤酵母（Pichia stipitis58376）對脫毒后的水解液進行酒精發酵。結果表明：樹干畢赤酵母對玉米秸稈水解液中抑制劑很敏感，經過3種方法脫毒處理后，酒精得率都得到明顯提高。最佳的脫毒方法是飽和生石灰法，酒精濃度達到12.2 g/L，理論酒精得率為69.31%[8]。

2 基因工程菌株

2.1 研究思路

目前對于五碳糖和六碳糖共發酵生產酒精的菌種研究除了自然微生物外、主要集中在對運動發酵單胞菌（Zymomonas mobilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等基因改造上。運動發酵單胞菌和釀酒酵母生長速度快，酒精得率高，但是不能夠利用五碳糖；而大腸桿菌雖然能夠利用六碳糖和五碳糖，但酒精得率低，副產物多，所以研究者往往運用基因工程手段來解決這些微生物五碳糖和六碳糖共發酵的問題[9-11]。目前研究思路主要包括兩點：一是在高效代謝六碳糖的菌種中引入五碳糖代謝途徑；二是向能利用混合糖但酒精得率低的菌種中引入高產酒精關鍵酶基因，例如來自運動發酵單胞菌的兩個酒精轉化重要基因 pdc（丙酮酸脫羧酶基因）及adh（酒精脫氫酶基因）。通過這兩種方法實現五碳糖和六碳糖高效酒精發酵。

2.2 五碳糖和六碳糖代謝途徑

葡萄糖是很容易利用的碳源，許多微生物都能夠利用葡萄糖發酵生產酒精。葡萄糖首先經過糖酵解途徑或ED途徑生成丙酮酸，然后丙酮酸在丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶作用下生成酒精。

五碳糖的代謝主要是指木糖的代謝，傳統的釀酒酵母體內因缺乏木糖轉化為木酮糖的酶，因而不能利用木糖，但可以利用木糖的異構體——木酮糖。自然界中木糖可以通過兩種途徑轉化為木酮糖。在真菌中，木糖在木糖還原酶（xylose reductase）和木糖醇脫氫酶（xylitol dehydrogenase）的共同作用下使木糖轉化為木酮糖；而在細菌中，則通過木糖異構酶（xylose isomerase）一步轉化為木酮糖[7]。木糖能夠轉化為木酮糖是實現木糖酒精發酵的關鍵。利用木糖進行酒精發酵，代謝途徑如圖1所示。木糖轉化為木酮糖后，經過木酮糖激酶磷酸化形成5-磷酸木酮糖，在轉醛醇酶和轉酮醇酶的作用下，5-磷酸木酮糖進一步轉化成葡萄糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸，由此進入磷酸戊糖途徑（PPP）[12-13]，最終丙酮酸脫羧還原為酒精。

2.3 重組運動發酵單胞菌

運動發酵單胞菌是目前唯一通過ED途徑厭氧發酵葡萄糖的微生物。它擁有高效的將丙酮酸轉化成酒精的丙酮酸脫羧酶（pdc）和酒精脫氫酶（adh）酶系統，因此運動發酵單胞菌生長速度快，酒精得率高，但是不能利用五碳糖[14-16]。因而可以將與五碳糖代謝途徑有關的酶引入到該細胞中，從而構建重組運動發酵單胞菌，使其能代謝利用五碳糖。

這些酶包括木糖異構酶xylose isomerase、木酮糖激酶xylulokinase、轉醛醇酶transaldolase和轉酮醇酶transketolase。

人們早期僅僅將木糖異構酶基因以及木酮糖激酶基因轉入到運動發酵單胞菌中，但研究結果并不理想，主要因為轉醛醇酶和轉酮醇酶的活性太低，而這兩種酶是五碳糖代謝的關鍵酶。后來美國可再生能源實驗室Zhang等[17]將來自大腸桿菌的木糖異構酶（XI）、木酮糖激酶（XK）、talB（轉醛醇酶基因）和tktA（轉酮醇酶基因）一同轉入到運動發酵單胞菌中，得到重組運動菌株Z.mobilisCP4（pZB5）。然后利用該菌株以木糖（25 g/L）作為唯一碳源進行酒精發酵試驗，酒精產率可達到理論值的86%，而在由木糖和葡萄糖各25 g/L 組成的混合培養基中進行酒精發酵試驗，兩種糖的轉化率都可以達到95%。后來Zhang 等又利用同源重組技術將運動發酵單胞菌進行木糖發酵所需要的7個基因進行染色體整合，整合菌株在由 4% 葡萄糖和 4%木糖組成的混合培養基中進行酒精發酵試驗，酒精產率達到理論值的83%。這個結果與前面重組菌株CP4的酒精得率結果非常接近，但整合菌株大大增加了外源基因的穩定性，酒精發酵的副產物也明顯減少。

Chou 等[18]利用磷酸戊糖途徑的7 個代謝基因構建了能同時發酵葡萄糖和木糖的基因工程菌株pZB301，對含葡萄糖30 g/L、木糖30 g/L混合培養基進行酒精發酵試驗，酒精的得率達到理論值的82%～84%。

圖1 五碳糖和六碳糖酒精發酵途徑

但是以上這些菌種由于木糖代謝基因都存在于質粒中，為防止質粒的丟失，往往在培養基中加入一定量的抗生素，這也將增加生產成本。

2.4 重組大腸桿菌

大腸桿菌可以利用葡萄糖等六碳糖和木糖等五碳糖進行酒精發酵。由于大腸桿菌的代謝機制以及糖代謝途徑比較復雜，體內缺乏強有力的酒精發酵酶系統，酒精只是其代謝產物中很小的一部分。因此對于大腸桿菌的改造目標是增強其產酒精的能力，可采用基因工程手段將運動發酵單胞菌的兩個酒精轉化重要基因pdc及adh克隆到大腸桿菌中，組成PET 操縱子進行酒精發酵。

Ingram等[19]在20世紀80年代利用運動發酵單胞菌中的高活力丙酮酸脫羧酶基因和酒精脫氫酶基因構建了PET 操縱子（pLOI297），并將該操縱子導入到大腸桿菌中構建成基因工程菌，然后利用該工程菌發酵葡萄糖生產酒精，酒精產量達到理論值的84%。Escherichia coliK011是帶有PET操縱子的一種染色體整合菌。 其中木糖異構酶基因和木酮糖激酶基因的表達水平分別是出發菌株的3倍多和2倍多，被認為是近來用于發酵混合糖產酒精的比較理想的菌種之一[20]。Moniruzzaman等[21]采用該菌株對玉米纖維氨爆破產物進行酒精發酵試驗，水解液混合糖含量為47 g/L，最終酒精濃度為21 g/L，酒精得率達到理論值的98%。但是，在葡萄糖和木糖共存時，該菌株總是優先利用葡萄糖，然后再利用木糖。后來Yomano等[22]對KO11的適應性進行研究，獲得了對酒精具有較強耐受性的新菌株LY01，利用該菌株對140 g/L木糖進行發酵，酒精濃度達到了60 g/L，發酵時間也由120 h縮短為96 h，并且對木質纖維素水解產物中抑制劑的耐受性遠高于 KO11。高文等[23]將大腸桿菌丙酮酸甲酸裂解酶pfl基因連同運動發酵單胞菌的pdc和adh基因一同轉入大腸桿菌TOP10感受態細胞中，獲得重組菌E.coliTOP10-pfl，也能穩定地利用葡萄糖和木糖產酒精，從而在大腸桿菌中建立了一條新的代謝糖產酒精的途徑。

2.5 重組釀酒酵母

釀酒酵母是傳統酒精工業生產經常使用的優良菌株，由于體內缺乏木糖轉化為木酮糖的酶，因此不能利用木糖，只能利用木酮糖。為解決此問題，人們在釀酒酵母體內引入能夠轉化木糖為木酮糖的代謝途徑，使其能夠利用木糖[24-25]。

楊忞等[26]利用休哈塔假絲酵母的木糖還原酶基因 XYL1和熱帶假絲酵母的木糖醇脫氫酶基因XYL2，分別構建出重組表達質粒 pACT2-xyl1和pDR195-xyl2，并利用這兩個質粒構建出重組酵母染色體整合質粒 YIp5-kanR-x12，希望通過同源重組技術將其整合到釀酒酵母中，得到穩定代謝葡萄糖和木糖產酒精的重組酵母菌株。葉凱等[27]將木糖還原酶基因xyl1和木糖醇脫氫酶基因xyl2串聯在一起，導入含組成型GAP的PYES2載體中，構建了PYES2-GAP-xyl1-xyl2質粒，然后導入到釀酒酵母中，該重組釀酒酵母能高效利用秸稈中纖維素和半纖維素降解的五碳糖和六碳糖，并且申報了專利技術。沈煜等[28]將木酮糖激酶基因 （XYL3）克隆到已含有XYL1和XYL2基因的釀酒酵母轉化子中，得到重組釀酒酵母 HSXY-251，與原始菌株相比，木糖醇的產量降低了84.9%，酒精產量提高了36%。另外研究發現，利用基因工程手段構建重組釀酒酵母時，必須同時提高轉化子的木酮糖激酶（XK）活性。然而由于木糖代謝途徑下游不暢以及氧化還原不平衡等原因，目前重組釀酒酵母的木糖代謝工程還有待進一步研究。

2.6 其 它

除了前面介紹的自然微生物、重組運動發酵單胞菌和重組大腸桿菌和重組釀酒酵母以外，還有一些其它產酒精細菌的相關報道。例如克雷白氏菌（Klebsiella oxytocaK），但野生克雷白氏菌的發酵產物主要為有機酸，酒精產量較低，對酒精耐受性也較差，因此對其進行改造難度較大。

3 結 論

利用纖維質原料生產酒精，關鍵之一就是找到能共發酵五碳糖和六碳糖的生產菌種。到目前為止，這方面的研究已經取得了許多進展，但仍有許多問題需要解決。第一，自然微生物普遍存在酒精生產能力低、耐受性較差、副產物多等缺陷；而通過基因工程手段獲得的重組菌，酒精產率和耐受性仍然偏低。第二，用于改良的菌株多以實驗室菌株為主，改良后的菌株遺傳性狀不穩定，活力較差，難以工業化應用。第三，目前研究還有很大的局限性。人們只是對某個代謝途徑中單個基因或者幾個基因進行了改造，也就是只改變了細胞局部代謝平衡，對木糖整個代謝中出現的問題并沒有完全解決，所以結果并不理想。

從木糖代謝途徑的基因組層面上進行定向進化或同時改變多個相關基因群，使細胞代謝從整體上發生改變，從而適應木糖酒精代謝的需求。另外對重組菌進行隨機突變、進化選育并結合現代高通量篩選等技術，將是未來研究工作的重點。

相信隨著基因工程、代謝工程以及蛋白質工程等學科的發展，全面了解產酒精微生物代謝網絡的生理功能和調控機制，進一步優化細胞內物質流、信息流和能量流的分布，將會推動燃料酒精的發展。

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