二十二碳六烯酸聯合5-氟尿嘧啶對人肝癌細胞HepG2耐藥相關蛋白表達的影響

李群珍鄧紅何勁松伍茵張茂祥藍偉紅

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二十二碳六烯酸聯合5-氟尿嘧啶對人肝癌細胞HepG2耐藥相關蛋白表達的影響

李群珍1鄧紅2★何勁松1伍茵1張茂祥1藍偉紅1

目的研究二十二碳六烯酸（DHA）聯合5氟尿嘧啶（5-FU）對人肝癌細胞HepG2耐藥相關蛋白ERK、JNK及p38的表達。方法Western blot檢測5-FU 5μg/mL，或5-FU 5μg/mL聯合DHA 30 μg/mL作用HepG2細胞48 h后ERK、JNK及p38蛋白表達。結果與單用5-FU組比較，5-FU聯合DHA組對耐藥相關蛋白的影響，p-ERK明顯受到抑制，而p-JNK表達顯著增加，p-p38表達無差別。結論DHA對肝癌細胞耐藥相關蛋白的調控可能通過抑制ERK、激活JNK信號通路來增強5-FU的細胞毒活動，發揮增敏化療藥物的作用。

二十二碳六烯酸；5-氟尿嘧啶；肝癌；多藥耐藥；絲裂原活化蛋白激酶

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）是人體必需脂肪酸，主要從深海魚油中獲得[1]。近年來多項流行病學及基礎研究發現，DHA不僅對多種惡性腫瘤具有抑制作用，而且能夠增強化療藥物5-氟尿嘧啶（5- fl uorouracil，5-FU）的療效[2]。但近年來，傳統化療藥物的長期應用使癌細胞耐藥現象越來越普遍，這大大影響了化療藥物的臨床應用。因此，研究腫瘤細胞對5-FU的耐藥機制、增加腫瘤細胞對5-FU的敏感性迫在眉睫。本研究以肝癌細胞株HepG2為主要對象,比較單用5-FU與5-FU聯合DHA對耐藥相關蛋白的表達。

1 材料與方法

1.1 肝癌細胞株

肝癌細胞HepG2來源于ATCC，購自中國科學院細胞庫，來源于一個15歲白人的肝癌組織。該細胞分泌多種血漿蛋白：清蛋白、α2-巨球蛋白、血纖維蛋白溶酶原、鐵傳遞蛋白等。該細胞能大容量培養，乙肝表面抗原陰性，對G418有抗性，對人生長激素有刺激反應。

1.2 細胞培養及處理

HepG2細胞是人肝癌細胞株，含青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）、0.3 g/L L-甘氨酸、0.85 g/L NaHCO3、10%小牛血清（56℃，滅活30 min）的DMEM完全培養液，在100%濕度、5% CO2培養箱中，37℃單層貼壁生長，待長至80～90%融合時，用0.25%胰酶消化傳代培養，每2～3天換液一次，每5 天傳代一次，收集指數期細胞進行實驗。

二十二碳六烯酸（cis-4，7，10，13，16，19-docosahexaenoic acid，SIGMA，USA）（St. Louis, MO），純度≥98%，融于無水酒精，濃度20 mg/mL，充滿氮氣后-80℃避光保存備用。

5-氟尿嘧啶（SIGMA，USA），融于二甲基亞砜DMSO（SIGMA，USA），濃度32 mg/mL，4℃避光保存備用。

1.3 方法

Western Blot檢測MAPK蛋白表達變化：提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，配制10%蛋白電泳分離膠和5%積層膠，蛋白變性上樣，上樣量30μg，按照積層膠電壓 70 V，分離膠電壓 100 V電泳，待溴酚藍指示劑遷移到凝膠底部時停止電泳。恒壓20 V，30 min半干電轉膜，5%的脫脂奶粉/TBS-T室溫封閉1 h，5%的脫脂奶粉/TBS-T 1:500稀釋相應的一抗，與PVDF膜4℃孵育過夜，TBS-T洗滌，同樣方法1:3000稀釋HRP標記二抗，室溫1 h，TBS-T洗滌后，ECL化學發光法檢測，Quantity one（Bio-Rad）軟件半定量分析。

1.4 統計學處理

2 結果

各組藥物干預后對ERK、JNK及p38蛋白表達的影響：利用Western Blot檢測5-FU 5 μg/mL，或5-FU 5 μg/mL聯合DHA 30 μg/mL作用HepG2細胞48 h后ERK、JNK及p38蛋白表達。結果顯示，與對照組比較，5-FU單獨處理組HepG2細胞的p-ERK表達下降，差異有統計學意義（P＜0.01），p-JNK表達增加，差異有統計學意義（P＜0.01），而p-p38表達無變化（P＞0.05）。

5-FU聯合DHA組與單用5-FU組比較，聯合組p-ERK較單用5-FU組表達明顯受到抑制（P＜0.01），而p-JNK表達增加，差異有統計學意義（P＜0.01），p-p38表達無差別（P＞0.05）（見圖1和表1）。

3 討論

肝癌目前仍是我國發病率居前列的腫瘤，雖然肝癌綜合治療方面已做了大量研究并取得了一定的效果，但肝癌術后5年總生存率仍不夠理想。化療是治療肝癌必不可少的手段之一，但有很大部分患者對化療藥物產生耐藥使得腫瘤細胞對化療藥物不敏感。單藥治療效果不佳，多藥聯合化療可減少腫瘤的耐藥性，提高治療效果。

最近研究表明DHA不僅本身具有抗癌作用，DHA和某些藥物有協同作用，可增強抗癌藥物的細胞毒性，提升腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，減少抗癌藥物的副作用。腫瘤化療藥物耐藥性的存在，尤其是多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）現象，嚴重阻礙了化療藥物的應用[3]。目前大多數研究都認為，ERK的過度激活與多種化療藥物的耐藥性存在明顯正相關，其作用機制可能是通過調控耐藥相關基因和蛋白的表達[4]。Weldon等[5]通過基因芯片技術對MCF7細胞株1 186個基因進行分析后發現，MEK5（ERK5上游激酶）的過表達與耐藥株APOMCF7的耐藥性存在明顯的相關性。Kisucká等[6]發現，鼠白血病細胞系的耐藥株L1210/VCR（長春新堿）多藥耐藥與ERK持續激活相關，其機制可能是ERK激活引起腫瘤細胞表面多藥轉運蛋白P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）基因表達量增加，P-gp可將藥物從細胞內泵出，使細胞內VCR濃度降低從而產生耐藥，而MEK特異性抑制劑PD98059和U0126可以抑制ERK活性，從而提高細胞內VCR濃度并且逆轉L1210/VCR的耐藥性。

表1 ERK、JNK、p38在不同處理組細胞中的表達水平（相對于內參GAPDH的條帶灰度值）Table 1 Expression level of JNK, ERK, and p38 in different groups（data of relative density compared with GAPDH）

圖1 5-FU單用或聯合DHA對HepG2細胞JNK、ERK及p38蛋白表達的影響Figure 1 Expression of JNK, ERK and p38 in HepG2 treated with 5-FU or 5-FU in combination with DHA for 48 hours

MDR癌細胞的存在是肝癌化療失敗的根本原因，因此，如何較滿意地解決肝癌細胞MDR問題已成為當務之急[7]。有資料表明，通過調節腫瘤細胞絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）系統的表達有可能逆轉MDR，成為腫瘤治療的新方法[8]。Chen等[9]發現胃癌細胞株MGC803預先用VCR處理72 h后，細胞內P-gp表達量增加，對VCR的耐藥性提高了2.24倍，加入PD98059可以抑制P-gp表達，并且逆轉MGC803對VCR的耐藥性。但是，對于JNK和p38的激活程度在腫瘤化療藥物的作用目前還存在很多爭議。一些研究發現，JNK和p38激活程度與腫瘤化療的敏感性存在正相關。如Mansouri等[10]比較了卵巢癌順鉑（CDDP）敏感株2008以及耐藥株2008C13中MAPK激活情況，發現敏感株JNK和p38的激活程度明顯超過耐藥株。然而，另一些研究卻發現JNK和p38的持續激活與腫瘤細胞的耐藥性正相關[11]。

為了研究DHA是否可通過增強5-FU細胞毒性的調控機制，我們研究了DHA聯合5-FU對MAPK信號通路的影響，Western Blot檢測證實DHA聯合5-FU較單獨使用5-FU組，ERK被抑制更加明顯，JNK被激活更加顯著，而p38活性沒有變化。這提示DHA可能通過抑制ERK或激活JNK活性，從而增強5-FU的細胞毒活性。

因此，在研究DHA聯合5-FU誘導肝癌細胞凋亡的分子機制時，采用Western Blot方法檢測5-FU單用或聯合DHA對HepG2細胞MAPK蛋白表達的變化，初步揭示DHA還可通過抑制ERK或激活JNK信號通路來增強5-FU的細胞毒活性。期望利用DHA通過不同通路協同化療藥物誘導細胞凋亡的特點，同時可靶向耐藥位點達到逆轉耐藥目的，拓展肝癌治療領域的研究，但是否能應用于臨床尚需在動物實驗和臨床試驗來進一步驗證。

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[5] Weldon C B, Scandurro A B, Rolfe K W, et al. Identification of mitogen-activated protein kinase kinase as a chemoresistant pathway in MCF-7 cells by using gene expression microarray[J]. Surgery, 2002, 132(2): 293-301.

[6] Kisucká J, Barancík M, Bohácová V, et al. Reversal effect of specific inhibitors of extracellular-signal regulated protein kinase pathway on P-glycoprotein mediated vincristine resistance of L1210 cells[J]. Gen Physiol Biophys, 2001, 20(4): 439-444.

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Effect of docosahexaenoic acid plus 5-fluorouracil on the drug-resistance associatedprotein of HepG2

LI Qunzhen1, DENG Hong2★, HE Jingsong1, WU Yin1, ZHANG Maoxiang1, LAN Weihong1
(1.Department of Nutrition, Second Hospital of Shenzhen, Guangdong, Shenzhen 518035, China; 2.Food and Nutrition Department, Public Health and Tropical Medicine of the Southern Medical University, Guangdong, Guangzhou 510515, China)

ObjectiveTo study the expression of drug-resistance associated protein, such as ERK, JUK and P38, in hepatocellular carcinoma HepG2 cells treated with docosahexaenoic acid and 5- fl uorouracil.MethodsThe expression of JNK, ERK and p38 were analyzed in HepG2 treated with 5-FU or 5-FU in combination with DHA for 48 hours by western blot.ResultsWhen compared with the group only treated with 5-FU, samples from the group treated with 5-FU and DHA showed different expression level of drugresistance associated-proteins. Down regulation of p-ERK, up regulation of p-JNK and no change of p-p38 could be found in the latter group.ConclusionWith inhibiting the p-ERK and activating p-JNK, DHA could regulate hepatocellular carcinoma cells to signi fi cantly enhance the cytotoxic activity of 5-FU. So that it could play a role in the sensitization of chemotherapy drugs.

Docosahexaenoic acid (DHA); 5- fl uorouracil (5-FU); Primary liver cancer; Multidrug resistance (MDR); Mitogen-activated protein kinase (MAPK)

1.廣東省深圳市第二人民醫院營養科，廣東，深圳 518035

2.南方醫科大學公共衛生與熱帶醫學院營養與衛生學系，廣東，廣州 510515

★通訊作者：鄧紅，E-mail: hongd@ fi mmu.com