40例慢性乙型肝炎患者血清HBV P基因變異及突變頻率檢測

趙建華，吳月平（江蘇省南通市第三人民醫院 226006）

拉米夫定（LAM）在臨床應用過程中耐藥發生率較高，治療1年，其基因型耐藥率為14%～32%，治療5年后，此耐藥率達到60%～70%。阿德福韋酯（ADV）對HBV 野生株和LAM 耐藥株均有明顯抑制作用。恩替卡韋（ETV）對HBV 復制有較強的抑制能力，其治療5年的基因型耐藥率為1.2%，臨床耐藥率為0.8%。多個核苷類抗病毒藥物聯合或序貫治療可導致對多個核苷類似物耐藥的HBV 毒株產生。HBV 以稱為“準種（quasispecies）”的遺傳學上緊密聯系而又互不相同的變異群體的形式存在于任一宿主體內，在環境壓力和自身適應力的共同選擇下不斷進化。本試驗對接受核苷（酸）類藥治療的慢性乙型肝炎患者的血清、病毒學標志物及體內HBV 準種的演變進行了初步研究，以探討乙型肝炎病毒聚合酶（HBV P）基因變異特點、突變頻率及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料對2008年12月至2011年6月南通市第三人民醫院感染科送檢的40例慢性乙型肝炎患者血清標本進行HBV P基因分析，其中男性患者34例，女性患者6例。年齡22～63歲。患者分別處于接受核苷（酸）類藥物治療前、中、后，有完整的核苷（酸）類治療病史記錄，單用拉米夫定（LAM）3例、阿德福韋酯（ADV）3例、恩替卡韋（ETV）3例、替比夫定（L－dT）3例，28例序貫治療或聯合治療均在臨床治療欠佳或出現病毒學甚至生物化學突破時使用。

1.2 方法

1.2.1 HBV 血清標志物對檢測 HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb采用微粒酶免疫法檢測（MEIA 法，Abbott試劑），血清中HBV－DNA 含量檢測采用熒光PCR 法（上海科華試劑）。

1.2.2 血清HBV－DNA 的抽提血清標本復融后，取50μL，加入50μL濃縮液，13000r／min離心10min；棄去上清液，往沉淀中加入50μL裂解液，煮沸10min，13000r／min離心10 min，上清液作為PCR 模板用于檢測。

1.3 儀器及設備定性PCR 擴增儀：PE9700；焦磷酸測序儀：Qiagen公司PyroMarkTM ID 遺傳分析系統；ABI7500熒光PCR 儀；雅培AXSYM 免疫分析儀；奧林巴斯AU2700生化儀；WD－9413A 凝膠成像儀。

1.4 引物設計和合成、PCR 產物檢查、PCR 產物的焦磷酸測序委托南京迪安醫學檢驗所完成。測序：按照PyroMark ID 遺傳分析系統和配套試劑盒說明書，用SNP模式進行PCR 產物HBV 相關位點的焦磷酸測序。結果分析：根據檢測序列的堿基序列判斷突變類型，特有的基因頻率分析，可準確獲得病毒突變株的比例。

2 結果

40例慢性乙型肝炎患者抗病毒治療時間0～80個月不等；5例患者基線時進行變異株檢測結果呈陰性；40例患者中18例發生變異占較高比例，其中單點變異M204V／I 2例、A181V／T 1例、V173L1例，兩點或三點變異分別為L180M＋M204V／I 7例、V173L＋M204V／I 1例、L180M＋N236T1例、A181V／T＋N236T1例、V173L＋L180M ＋M204V／I 2例、A181V／T＋N236T＋M204V／I 1例，L180M ＋M204V／I＋S202G1例，未檢出I169T、T184G、A194T、M250V 等突變；突變頻率20%～100%；變異株中M204V／I突變頻率高（14例患者中12例為100%），未見單獨L180M 變異；HBV P 基因區變異株可以在HBV－DNA、ALT 發生突破前、中、后檢出；HBeAg、HBeAb陽性者P基因變異率分別為46.2%（12／26）、41.7%（5／12）（P＞0.05），2例HBeAg、HBeAb均陰性者中1例P基因區變異。詳細信息見表1。

表1 40例慢性乙型肝炎患者抗病毒治療與基因變異模式的關系

3 討論

本文資料顯示，抗病毒治療基線時未檢出變異株，Zhang等［1］用基因克隆的方法研究了5例拉米夫定治療48周血清HBV－DNA 仍為陽性的慢性乙型肝炎患者，分別對治療前和治療48周的血清進行RT 區基因克隆，每個樣本挑取20～24個克隆，發現在治療前3例患者血清中已存在YMDD 變異株，比例分別為9.5%、4.5%和5.6%，治療48周時有2例YMDD變異株成為優勢株并發生病毒學和生化學突破，這可能與實驗方法不同、選擇病例有關，作者以往研究亦發現治療前血清中YMDD 變異株的存在［2］。本研究40例患者中18例發生變異占較高比例，其中單點變異M204V／I 2例、A181V／T 1例、V173L1例，兩點或三點變異分別為L180M＋M204V／I 7例、V173L＋M204V／I 1例、L180M ＋N236T1例、A181V／T＋N236T1例、V173L＋L180M ＋M204V／I 2例、A181V／T＋N236T＋M204V／I 1例，L180M＋M204V／I＋S202G1例，未檢出I169T、T184G、A194T、M250V 等突變；而鄧俊等［3］報道發現了V207I、S256C、A222T、L229V 等耐藥相關變異，這與治療時間長短、多種藥物序貫聯合治療有關。變異株中M204V／I突變頻率高（14例患者中12例為100%），未見單獨L180M變異。這是由于M204V／I（YMDD 變異）被稱為主要耐藥突變，它的出現可大大降低病毒對拉米夫定的敏感性，而其余的變異則被稱為代償變異，常常與YMDD 變異同時出現，一定程度上能夠恢復YMDD 變異病毒的復制能力［4］。本研究從40例患者臨床用藥種類與變異模式的關系發現，L180M、M204V／I變異與拉米夫定、替比夫定和恩替卡韋耐藥相關，V173L突變與拉米夫定耐藥相關，S202G 與阿德福韋耐藥相關；A181V／T、N236T 突變與阿德福韋耐藥相關。HBeAg、HBeAb陽性者P 基因變異率分別為46.2%（12／26）、41.7%（5／12）（P＞0.05），2例HBeAg、HBeAb均陰性者中1例P基因區變異。而Lim 等［5］在研究HBV 前C／C 基因區準種演變與IFN 治療后HBeAg血清轉換的關系，發現發生HBeAg血清轉換的患者在轉換前的準種多樣性和變異頻率明顯高于未發生HBeAg血清轉換者，且在發生轉換后，準種多樣性明顯高于轉換前，認為HBeAg血清轉換前準種多樣性增高可能與打破免疫耐受有關，隨著免疫應答的增強，反過來促進HBV免疫逃逸，使準種多樣性增加，作者準備擴大臨床樣本進一步研究。HBV P基因區變異株可以在HBV－DNA、ALT 發生突破前、中、后檢出，結合HBV P基因區變異模式和突變頻率來看：核苷（酸）類藥抗病毒治療過程中HBV P基因準種大體變化為野生株為優勢株－野生株與變異株共存－變異株轉化為優勢株，HBV P基因區變異和突變頻率動態檢測有利于臨床療效判斷。

［1］Zhang X，Liu C，Gong Q，et al.Evolution of wild type and mutants of the YMDD motif of hepatitis B virus polymerase during lamivudine therapy［J］.J Gastroenterol Hepatol，2003，18（12）：1353－1357.

［2］王陸軍.拉米夫定治療過程中乙型肝炎病毒變異的分析［J］.交通醫學，2001，15（5）：503－504.

［3］鄧俊，張東華，于德敏，等.核苷（酸）類耐藥患者中乙型肝炎病毒逆轉錄酶區基因變異類型及其特點［J］.中華肝臟病雜志，2009，17（5）：342－345.

［4］Ono SK，Kato N，Shiratori Y，et al.The polymerase L528M mutation cooperates with nucleotide binding－site mutations，increasing hepatitis B virus replication and drug resistance［J］.J Clin Invest，2001，107（4）：449－455.

［5］Lim SG，Cheng Y，Guindon S，et al.Viral quasi－species evolution during hepatitis Be antigen serocon version［J］.Gastroenterology，2007，133（3）：951－958.