rAAV2/1-Acrp30對實驗性糖尿病對大鼠肝臟細胞形態學的影響

王 靜鐘惠菊周 軍李 瓊王適龍

（1 中南大學湘雅醫院，湖南 長沙 410078；2 中南大學湘雅三醫院，湖南 長沙 410013）

rAAV2/1-Acrp30對實驗性糖尿病對大鼠肝臟細胞形態學的影響

王 靜1鐘惠菊1周 軍2李 瓊1王適龍1

（1 中南大學湘雅醫院，湖南 長沙 410078；2 中南大學湘雅三醫院，湖南 長沙 410013）

目的 觀察rAAV2/1-Acrp30對實驗性糖尿病對大鼠肝臟細胞形態學的影響。方法 以高脂高糖喂養4周加上35mg/kgSTZ腹腔注射建立大鼠糖尿病模型，將其隨機分為糖尿病對照組組、脂聯素治療組、空病毒組，并設正常對照組。結果 模型組較正常對照組血糖、飲水量、體質量均明顯升高（P＜0.01），血清APN顯著下降（P＜0.01）；與糖尿病對照組及空病毒組相比，治療組的飲水量、空腹血糖的情況是顯著降低（P＜0.05），體質量上升（P＜0.05），血清TC、TG、LDL降低（P＜0.05），HDL明顯升高（P＜0.05）；肝臟形態學表明肝細胞結構清晰且完整，肝細胞脂肪變性與炎癥細胞浸潤呈減少的特點；肝臟APN的表達呈上升特點（P＜0.01），肝臟NF-κBp65、IκBα與IL-1β明顯降低（P＜0.05）。結論 rAAV2/1-Acrp30能夠降低血糖與血脂，較好的改善糖尿病大鼠肝臟炎性細胞的浸潤以及肝細胞脂肪變性。

實驗性；糖尿病；大鼠肝臟細胞；NF-κBp65

脂聯素（APN）具有增加胰島素敏感性、抗炎、抗動脈粥樣硬化以及抗糖尿病的功能，其循環濃度在胰島素抵抗或2型糖尿病等患者中[1]都降低，而給予小鼠的體內注射重組脂聯素就會使得模型鼠血糖降低同時優化胰島素抵抗[2]。本研究觀察rAAV2/1-Acrp30對實驗性糖尿病對大鼠肝臟細胞形態學的影響。

1 材料與方法

1.1 動物模型制備

8周齡雄性Wistar大鼠50只適應性喂養1周后隨機分為兩組，正常對照組（C）8只以普通飼料喂養，模型組（M）42只喂以高糖高脂飼料。4周后M組大鼠隔夜空腹腹腔注射STZ35mg/kg，C組僅注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。72h后大鼠測隨機血糖≥16.7mmol/L為糖尿病模型造模成功。

1.2 給藥方式

將造模成功的27只大鼠隨機分為糖尿病對照組、空病毒組以及脂聯素治療組，每組n=9。各組大鼠從造模成功次日開始給藥rAAV2/1-Acrp30基因（滴度為1012 vector genomes/mL，vg/mL，由前期實驗組構建[3]）。觀察4周后處死。在這階段，正常對照組進行普通飼料的喂養，其余3組則予以高糖高脂的飼料進行喂養。

1.3 生化指標檢測

分別于4周、8周末斷尾取血測血糖（BG），8周末隔夜空腹從心臟取血測定FBG，血清TG、TC、HDL、LDL、APN，之后將其處死。FBG用強生快速血糖儀進行測定；血清TG、TC等則用全自動的生化分析儀進行測定，血清脂聯素采用酶聯免疫法。

1.4 肝臟組織病毒組織學觀察

取小塊的肝組織4%多聚甲醛固定，用石蠟包埋，切片，Masson染色及Red-oil特殊染色，對病理情況進行觀察[4]。

1.5 免疫組化染色和圖像分析

免疫組化染色采用ABC法，DAB顯色，并以PBS作空白對照。陽性結果是胞漿/胞核染成棕黃色。組織切片都通過NIS-Elements AR 3.0軟件拍照來收集到全組織的切面圖像。用雙盲法來進行分析，在高倍鏡下隨機的確定10個視野，計同類細胞中陽性細胞所具有的個數，取樣本的平均值進行組間的比較。

1.6 統計學處理

所有數據用SPSS17.0統計軟件處理，組間比較，采用t檢驗和SNK-q檢驗或非參數檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 rAAV2/1-acrp30對糖尿病大鼠一般情況影響

C組大鼠在整個實驗過程中精神狀態良好，活動靈活，毛色光潔，后期體質量增加。D組和V組大鼠精神狀態萎靡，毛色晦暗、枯黃，進食量、尿量、飲水量增加，體質量減輕。A組大鼠精神狀態可，活動靈活，毛色稍晦暗，進食量、尿量、飲水量較D組和V組有減少，后期體質量略有增加。

2.2 rAAV2/1-acrp30對糖尿病大鼠血糖、血脂和血清脂聯素的影響

血清指標顯示：rAAV2/1-Acrp30干預4周后，與D組和V組相比，A組血清FBG、TC、TG、LDL明顯降低（P＜0.05），HDL明顯升高（P＜0.05），血清APN無明顯差異（P＞0.05）。

2.3 肝臟肉眼觀察

模型組和空病毒組大鼠肝臟體積變大，外觀是灰黃色，邊緣呈圓鈍，質地軟，表現為典型肝脂肪變狀態。脂聯素組大鼠肝臟體積出現了增大，外觀為紅色偏黃，質地軟，和糖尿病對照組與空病毒組比有顯著的改善。

2.4 肝組織病理形態學變化

Masson染色顯示：C組大鼠肝小葉結構清晰，肝細胞結構正常，分界清，核圓同時清晰，位于細胞中央，肝竇排列也規則。D組和V組大鼠肝細胞呈大小不等的空泡變性，部分胞核出現被擠壓于細胞邊緣的情況，肝索排列紊亂，大量的炎性細胞浸潤。A組大鼠肝細胞索結構比較清楚，肝竇較為正常，出現少量炎性細胞浸潤。在四組中，都沒有發現藍色纖維組織。箭頭所指處表示炎性細胞浸潤。

Red-oil染色顯示：C組肝組織可見極少量脂肪滴。D組和V組可見大量大小不等的脂肪滴存在。A組肝細胞脂肪變性明顯減輕，多以小脂滴狀存在。

2.5 rAAV2/1-acrp30對糖尿病大鼠肝臟APN及NF-κBp65、IκBα、IL-1β免疫組化染色的影響結果見表1。

表1 各組大鼠APN、NF-κBp65、IκBα、IL-1β比較（）

表1 各組大鼠APN、NF-κBp65、IκBα、IL-1β比較（）

注：與C組比較AP＜0.01，aP＜0.05；與D組比較BP＜0.01，bP＜0.05；與V組比較CP＜0.01，cP＜0.05

組別鼠數APNNF-κBp65IκBαIL-1β C614.33±4.3212.5±3.390.33±0.520.50±0.55 D76.00±2.24A61.14±8.86A5.43±1.62A7.71±1.98AV75.43±2.82A55.29±6.10A5.14±1.95 A7.86±2.16AA717.86±4.02BC28.86±5.37ABC2.71±1.89abc5.14±1.35Abc

肝臟APN的表達提示：A組較D組和V組顯著升高（P＜0.01），D組和V組較C組顯著降低（P＜0.01）；肝臟NF-κBp65、IκBα、IL-1β的表達提示：A組較D組和V組明顯降低（P＜0.05），D組和V組較C組明顯增加（P＜0.01）。

3 討 論

本研究結果表明，在糖尿病時，模型組肝臟中NF-κBp65、IκBα等的表達都較對照組是增加的，而在rAAV2/1-Acrp30治療一定階段后，細胞因子在治療組較對照組與空病毒組是降低的，且差異性比較明星，可以推測：NF-κBp65、IκBα、IL-1β在糖尿病時在肝臟的表達明顯升高，提示其參與了糖尿病的產生與發展，因而可通過抑制NF-κB、IκBα、IL-1β的活化，減少其產生，從而降低肝內炎癥的反應。

綜上所述，用腺相關病毒重組脂聯素治療可以降低血糖，優化脂質代謝紊亂，優化糖尿病大鼠肝臟炎性細胞的浸潤與肝細胞的脂肪變性，減少IL-1β等炎癥因子在肝臟的表達，降低炎癥反應，更好的保護患者的肝臟，緩解糖尿病。

[1] Hotta K,Funahashi T,Arita Y,et al.Plasma concentrations of a novel,adipose specific protein,adiponectin,in type 2 diabetic patients[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2000,20(6):1595-1599.

[2] Maeda N,Shimomura L,Kishida K,et al.Diet-induced insulin resistance in mice lacking adiponectin/ACRP30[J].Nature Med, 2002,8(7): 731-737.

[3] 李強翔,鐘惠菊,盛杰,等.重組腺相關病毒介導的大鼠脂聯素載體的構建與鑒定[J].現代生物醫學進展,2008,8(3):430-433.

[4] 于淼,樸春紅.從毒損肝絡探討胰島素抵抗、2型糖尿病炎癥發病機制[J].中華實用中西醫雜志,2006,19(6):614-615.

R587.1；R-33

B

1671-8194（2013）36-0038-02