評價自身抗體聯合檢測在診斷自身免疫性疾病中的應用

孫善會 鄭 燕* 張茂修

(山東大學附屬濟南市中心醫院醫學實驗診斷中心，山東 濟南 250013)

評價自身抗體聯合檢測在診斷自身免疫性疾病中的應用

孫善會 鄭 燕* 張茂修

(山東大學附屬濟南市中心醫院醫學實驗診斷中心，山東 濟南 250013)

目的 探討檢測抗核抗體（ANA）核型與抗可提取性核抗原(ENA)抗體及抗雙鏈DNA（ds-DNA）抗體之間的相關性，提高對自身免疫性疾病(AID）的診斷及鑒別診斷參考價值。方法 資料來源門診及住院的AID病例血清標本進行檢測，ANA檢測采用間接免疫熒光法（IIF），抗ENA抗體檢測采用歐蒙斑點法（抗nRNP/Sm、Sm、SSA/Ro、SSB/Lo、Scl-70和Jo-1）六項抗體及抗(ds-DNA)抗體采用ELISA法檢測。結果 在98例ANA陽性病例血清標本中核型分布為：細胞核均質型(36.74%)，細胞核顆粒型(41.84%)，細胞核仁型(11.22%)，細胞核膜型(1.02%)，細胞核著絲點型(1.02%)；重疊核型中細胞核均質型/細胞核顆粒型(2.04%)，細胞核均質型/細胞漿顆粒型（6.12%）等。98例ANA與ENA同時陽性血清標本中42例抗雙鏈DNA抗體陽性(42.86%)。36例均質型陽性樣本中抗SSA/Ro抗體(24.48%)，抗SSB/Lo抗體(6.12%)，抗nRNP/Sm抗體(6.12%)。41例細胞核顆粒型陽性樣本抗nRNP/Sm抗體(19.39%)，SSA/Ro抗體(15.31%)，抗SSB/Lo抗體(6.12%)。ANA陽性可出現一種或多種自身抗體。結論 ANA常見核型有：細胞核顆粒型，細胞核均質型及細胞核仁型。ANA均質型核型檢出的抗ds-DNA抗體為主，且抗ds-DNA抗體含量與熒光強度成正比。ANA核型與抗ENA抗體二者之間有一定的相對應性。ANA及核型、抗ENA抗體和抗ds-DNA抗體的聯合檢測可明確診斷AID，而且利于判斷患者血清中各種自身抗體與臨床表現的關系。

抗核抗體；抗ENA抗體；抗雙鏈DNA抗體；間接免疫熒光法；細胞核型

ANA主要用于AID的篩查。ANA所針對的靶抗原包括細胞的全部成分。隨著對特異性抗體的認識，從只檢測總抗體逐步過渡到針對抗原蛋白分子表位靶位點的特異性抗體檢測。AID血清中可檢測出多種特異自身抗體，目前臨床多以ANA、抗ENA抗體和抗抗ds-DNA抗體聯合檢測應用較多的項目，抗ENA抗體又稱鹽水可提取性核抗原抗體屬于抗核抗體，ENA是細胞內許多小分子的RNA和多肽組成的非組蛋白的酸性核蛋白顆粒，主要有六種：抗nRNP抗體（抗核內的核糖核蛋白抗體）、抗Sm抗體（核內小核糖體蛋白抗體）、抗SSA/Ro抗體、抗SS-B/La抗體、抗Scl-70抗體、抗Jo-1抗體。抗dsDNA抗體又稱抗脫氧核糖核酸抗體,其反應座位點位于DNA脫氧核糖磷酸框架上。本組病例對2008年10月至2009年12月在本院門診和住院病例ANA陽性樣本的測試結果在AID疾病中進行分析，探討ANA特異性熒光模式與抗ENA抗體及抗ds-DNA抗體之間的相對應性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

2008年10月至2009年12月我院門診及住院病例。AID患者ANA陽性98例，其中男性6例，女性92例，年齡15～83歲，平均年齡48.40歲。

1.2 試劑與步驟

1.2.1 ANA檢測

ANA間接免疫熒光法（IIF），德國歐蒙公司試劑。實驗嚴格試劑操作說明書，血清稀釋1∶100后，取25μL血清與包被HEp-2細胞及大鼠肝組織生物載片室溫（18～25℃）反應30min。磷酸鹽吐溫緩沖液沖洗反應板，緩沖液再浸泡5 min。加FITC標記的羊抗人球蛋白（熒光二抗）20μL。室溫育30min，再同上法磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌浸泡，甘油封片后熒光顯微鏡下觀察Hep-2細胞和大鼠肝組織,此時熒光素標記的抗人抗體與結合在生物基質上的抗體反應，形成在熒光顯微鏡下觀察到的特異性的熒光模型。特異性染色熒光在Hep-2及大鼠肝細胞中顯現為陽性。無熒光可判斷為陰性，陽性病例根據著色位置判斷反應區熒光染色核型。

表2 98例ANA陽性病例中抗ds-DNA抗體陽性分布

表3 98例ANA與抗ENA抗體陽性病例分布

表4 抗ds-DNA抗體陽性與抗ENA抗體陽性病例分布

1.2.2 抗ENA抗體測定

德國歐蒙公司試劑。根據試劑盒操作說明進行實驗，該歐蒙斑點法檢測六種人抗nRNP/Sm．Sm、SSA/Ro、SSB/Ro、Scl-70和Jo-1特異抗體的體外定性檢測，載片上2條實驗膜條上平行包被了經親和層析純化的六種抗原。第一次溫育將患者標本血清1∶100稀釋后的稀釋血清50μL加入反應板中與膜條上的抗原結合反應，血清中特異性的IgG抗體可與相應抗原反應結合。為充分結合反應在300rpm旋轉搖床上室溫溫育30min。緩沖液沖洗后反應板后加入堿性磷酸酶酶標抗人IgG進行下一步放置溫育30min，再一次沖洗后加入顯色底物液以產生反應顯色?？捎^察到包被各抗原條帶著色變化，反應顯色者為陽性。比對固定包被顯色位置，對特異抗體陽性做出判斷。

1.2.3 抗ds-DNA抗體檢測

采用愛爾蘭Trinity Biotech公司試劑的ELISA法。執行操作規程。1∶20倍血清稀釋后。每個微孔中加入100μL稀釋的血清標本和標準品，室溫30min，然后每反應空中加入300μL緩沖液洗滌5次，第二步加入酶標二抗100μL。室溫反應30min，再緩沖液洗滌5次。加入顯色底物液100μL，反應時間10min后混入終止液100μL，規定時間內酶標儀含（450nm吸光度值）測定。結果判定：比值是標本OD值/(標準液平均OD值×校正因子)，陰性值≤0.9，陽性值≥1.1，可疑值0.91～1.09。

1.3 儀器

熒光顯微鏡觀察ANA 熒光模型Olympus BX60型顯微鏡，激發濾片：488nm，分光濾片510nm，阻擋濾片520nm。光源：100W汞燈。酶標儀(美國Bio．Rad公司)在波長450nm處測吸光度值。

2 結 果

2.1 98例ANA陽性病例血清中，細胞核型分布見表1。ANA核型細胞核顆粒型(41例，41.84%)，ANA核型細胞核均質型(36例，36.74%)，ANA核型細胞核仁型(11例，11.22%)，ANA核型細胞核膜型(1例，1.02%)，ANA核型細胞核著絲點型(1例，1.02%)，細胞核均質型重疊細胞核顆粒型(2例，2.04%) ，細胞核均質型重疊細胞漿顆粒型（6例，6.12%）等。唯一細胞核型可出現，亦有兩種或兩種以上核型重疊同一病例中。常見ANA核型陽性率最多的為核顆粒型，其次為均質型和核仁型。

表1 98例ANA陽性核型分布

2.2 98例ANA陽性病例血清中ds-DNA抗體陽性分布見表2。42例抗ds-DNA抗體陽性(42/98，42.86%)。該組ANA、抗dsDNA抗體同時陽性樣本中均質型(21/42，50%)，細胞核顆粒型(20/42，47.62%)。

2.3 98例ANA與抗ENA抗體均陽性見表3。抗ENA抗體中抗SS-A/Ro抗體（54例，55.11%），抗SS-B/La抗體（16例，16.32%），抗nRNP/ Sm抗體（27例，27.55%），抗Scl-70抗體(1例，1.02%)，抗Jo-1抗體（0例）。ANA核顆粒核型，抗nRNP/Sm抗體檢出率最高。

2.4 表4中抗ds-DNA抗體與抗ENA抗體分布分析。ds-DNA陽性時，抗ENA抗體可唯一出現或兩種以上特異自身抗體出現，抗SSA/Ro陽性率最高。

3 討 論

AID篩查首選是ANA檢測，而IIF檢測ANA是經典方法，可檢測到整個細胞熒光染色模型，即ANA自身抗體的核型，這對AID的診斷不可或缺[1]ANA從抗細胞核抗原成分的自身抗體的檢測，擴展為檢測整個細胞核、細胞漿、細胞骨架、細胞分裂周期等成分[2]。IIF的ANA檢測優勢是檢測到廣義的ANA，衛生部臨檢中心核型分為：細胞核均質型、細胞核顆粒型、細胞核核仁型、細胞核核膜型、細胞核著絲點型、細胞漿胞漿顆粒型及細胞漿胞漿纖維型等核型。試劑選擇通過2種抗原基質HEp-2細胞和大鼠肝組織的特異染色分布的觀察，更能準確分析以上多種核型。ENA是可提取性核抗原的總稱，是細胞核和細胞漿中抗小分子核糖核蛋白的自身抗體，分子中不含DNA，該組成使其各自的抗原性得以增強?？笵NA抗體中抗dsDNA抗體。又稱抗脫氧核糖核酸抗體。

98例ANA陽性血清標本中，常見核型有細胞核顆粒型41/98(41.84%)、細胞核均質型36/98(36.74%)和細胞核仁型11/98(11.22%)。98例ANA與抗ENA抗體同時陽性血清標本中，抗ds-DNA陽性率為42例42.86%。在42例抗ds-DNA陽性血清中，細胞核均質型21/42(50%)，細胞核顆粒型20/42(47.62%)，細胞核模型1/42(2.38%)?？筪s-DNA抗體，主要和核型是均質性和核顆粒型，少有細胞核模型。

98例ANA陽性血清標本中，54例抗SS-A抗體陽性，細胞核均質型24(24.49%)，細胞核顆粒型15(15.31%)，細胞核仁型10(10.21%)，54例抗SS-A抗體陽性中抗ds-DNA抗體陽性27例，SS-A抗體陽性可一種或一種以上多核型重疊出現，與抗ds-DNA等多種抗體存在相關.國內外報道，AID中是一種以免疫調節異常為特征的自身免疫性疾病，例如系統性紅斑狼瘡(SLE)，個體血清中可出現一種或多種自身抗體ANA核型[3]?？筪s-DNA抗體是SLE特異標志抗體陽性率(40%～90%)均質型的高滴度的ANA標本可高頻率檢出抗ds-DNA抗體 ，抗ds-DNA抗體含量與ANA熒光強度成正比[4]?？笶N抗體中Sm抗體也是SLE的標記抗體，ANA核型主要細胞核顆粒型熒光核型(19例，19.39%)。檢測發現，ANA包被基質熒光染色膜型與抗ENA抗體及抗ds-DNA抗體之間有相對應性，不同的特異抗體也可以顯現類同的熒光染色模型，而同一特異抗體可以在不同血清標本中顯現不同熒光染色模型。ANA熒光染色模型與特異性抗體有一定的相對應性，但沒有絕對的規律可循，但熒光核型可全面評估參考，對進一步特異性自身抗體檢測提供重要參考[5]。ANA核型熒光核型尤其對發現罕見特異抗體提供信息，本組病例收集檢測得到的抗Scl-70抗體、抗Jo-1抗體在就診人群中的陽性率低與樣本收集局限有關。

ANA檢測及核型分析，可針對性地選擇相關的特異抗體測定，避免了盲目地重復檢測。無癥狀人群中也有自身抗體陽性，這可能正如Nielen和Arbuckle等認為的自身抗體陽性的出現遠遠早于（甚至提前10年）臨床癥狀的出現和發病[6,7]。協同ANA、抗ENA抗體和抗ds-DNA抗體的檢測不僅對AID的診斷具有較高敏感性和特異性，并與臨床表現結合診斷，及早治療及預后提供有效信息。

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Association among ANA Patterns, Anti-ENA Antibody and Anti-dsDNA Antibody in Autoimmune Disease

SUN Shan-hui, ZHENG Yan, ZHANG Mao-xiu
(Medical Research and Laboratory Diagnostic Center, Jinan Central Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250013, China)

Objective To investigate the association among ANA patterns, anti-ENA antibody and anti-dsDNA antibodies in autoimmune diseases, and the reference significance of detecting these antibodies on the diagnosis and differential diagnosis of autoimmune diseases. Methods Serum samples from 98 pateints with autoimmune disorder were collected. ANA, anti-ENA and anti-dsDNA antibodies were detected using IIF, immuno-dot assay and ELISA. Results The distribution of different ANA nuclear types in the 98 samples was: pattern homogeneous (36.74%); pattern nucleoplasm granular (41.84%); pattern nucleolar (11.22%); pattern nuclear membrane (1.02%); pattern centromere (1.02%); pattern homogeneous/nucleoplasm granular (2.04%)and pattern homogeneous/cytoplasm granular (6.12%). These patterns may occur separately, also could appear at the same sample. Among these 98 samples with both ANA and anti-ENA positive, 42 cases were anti-dsDNA antibodies positive (42.86%). In the 36 patients with ANA-homogeneous, 24 cases were anti-SSA /Ro antibody positive, 6 cases were anti-SSB/La antibody positive, and 6 cases were nRNP/Sm antibody positive. While in the 41 ANA-nucleoplasm granular samples, the positive rates of SSARo, SSB/La and nRNP/Sm antibodies were 15.31%, 6.12% and 19.39%. One or several kinds of ENA antibodies could appear in patients with positive ANA and anti-dsDNA antibodies. Conclusion The familiar nuclear types of ANA include pattern nucleoplasm granular, pattern homogeneous and pattern nucleolar. They occur individually or concurrently, which was correlated with the appearance of anti-ENA and antidsDNA antibodies. Combined detection of ANA, ENA and dsDNA antibodies has higher specificity, sensibility and accuracy in the diagnosis of autoimmune diseases, and is better in describing the correlation of the auto-antibodies appeared in patients and his clinical manifestation, thus provide valuable reference index to the diagnosis, differential diagnosis and therapy of AID.

Antinuclear antibody; Anti-ENA antibodies; Anti-double stranded DNA antibodies; Indirect immunofluorescence; Nucleus type

R446；R593.2

B

1671-8194（2013）36-0020-03

*通訊作者：E-mail:cnfu@sina.com