甲硝唑栓微生物限度檢查方法學驗證

2013-07-07 15:14:43費夷敏魏宇梅林夢感楊國紅王曙光

中國醫藥指南 2013年33期

費夷敏洪巖魏宇梅林夢感楊國紅王曙光*

（上海現代制藥股份有限公司，上海 201802）

甲硝唑栓微生物限度檢查方法學驗證

費夷敏洪巖魏宇梅林夢感楊國紅王曙光*

（上海現代制藥股份有限公司，上海 201802）

目的建立甲硝唑栓的微生物限度檢查方法。方法按照《中華人民共和國藥典》2010版二部修訂版的新要求進行方法學驗證，采用了薄膜過濾法對細菌、真菌及酵母菌計數和控制菌的檢查。結果細菌、真菌及酵母菌的回收率均70.0%以上，控制菌檢查中，各陽性試驗菌均檢出，陰性對照無菌生長。結論薄膜過濾法可消除甲硝唑栓的抑菌作用，適用于該制劑的微生物限度檢查。

甲硝唑栓；微生物限度檢查；薄膜過濾法；驗證

甲硝唑栓具有抗原生動物和專性厭氧細菌的作用，適用于治療滴蟲性陰道炎及敏感厭氧菌所引起的細菌性陰道病，是婦科的常用藥物[1]。為了能夠有效的控制甲硝唑栓的質量，及保證甲硝唑栓微生物限度檢查方法的科學性和檢驗結果的準確性，筆者依據《中華人民共和國藥典》2010版二部修訂版對微生物限度檢查的最新要求，進行了微生物限度檢查方法學的驗證。

1 材料

1.1 培養基與試劑

胰酪大豆胨瓊脂、沙氏葡萄糖瓊脂、胰酪大豆胨肉湯、甘露醇氯化鈉培養基、溴化十六烷基三甲銨、沙氏葡萄糖肉湯、沙氏葡萄糖瓊脂、十四烷酸異丙酯。

1.2 菌種

金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003、銅綠假單胞菌CMCC（B）10104、枯草芽孢桿菌CMCC（B）63501、白色念珠菌CMCC（F）98001。本次微生物驗證所使用的菌種均來源于上海市藥品檢驗所，且菌株傳代均不超過5代，并采用適宜的菌種保藏技術，以保證試驗菌株的生物學特性。

1.3 樣品

甲硝唑栓(上海現代制藥股份有限公司,批號:130301規格:0.5g)。

1.4 儀器

電動吸引器、細菌培養箱、霉菌培養箱、隔水式電熱恒溫培養箱、蒸汽滅菌器、濾器、凈化工作臺、藥物天平、錐形瓶、試管、培養皿（9cm）、微量移液器。

2 方法與結果

2.1 菌液的制備

取經過培養箱30～35℃培養24h的金黃色葡萄球菌（26003）、銅綠假單胞菌（10104）、枯草芽孢桿菌（63501）肉湯培養物，以10倍稀釋至含50～100cfu/mL，做活菌計數用。取經20～25℃培養24h的白色念珠菌（98001）霉菌液體培養物，以10倍稀釋至含50～100cfu/mL，做活菌計數用。

2.2 供試液的制備

無菌稱取甲硝唑栓供試品10g至含有無菌十四烷酸異丙酯的pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液20mL中（內含玻璃珠），振搖20～30min，使供試品完全溶解，然后加入45℃pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100mL混勻，用分液漏斗萃取，靜置，待水明顯分層時，取其水層，作為1∶10的供試液。

2.3 細菌、真菌及酵母菌計數方法驗證

2.3.1 試驗組

取供試液1mL放入到pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液500mL中，混勻后注人無菌濾杯中，進行薄膜過濾。再用pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗濾膜每次100mL，總沖洗量為500mL消除抑菌作用，并在最后一次的沖洗中加入了1mL的試驗菌（銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌），平行制備2份，取濾膜貼反面于胰酪大豆胨瓊脂平皿上，至規定溫度培養觀察結果[2]。取供試液10mL放入到pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液500mL中，混勻后注人無菌濾杯中，進行薄膜過濾。再用pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液500mL沖洗濾膜（每次100mL）消除抑菌作用，在最后一次的沖洗中加入試驗菌（白色念珠菌）菌液1mL，平行制備2份，取濾膜貼反面于沙氏4%葡萄糖瓊脂培養基平皿上，至規定溫度培養觀察結果。按中國藥典2010版二部--增補本XIIIH進行微生物檢查[3]。（n=3）。