常壓柱色譜與快速制備色譜分離純化洋鐵酸模中蒽醌成分

孫全樂(lè) 蔡廣知 殷 丹 貢濟(jì)宇

（長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，吉林 長(zhǎng)春 130031）

常壓柱色譜與快速制備色譜分離純化洋鐵酸模中蒽醌成分

孫全樂(lè) 蔡廣知 殷 丹 貢濟(jì)宇

（長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，吉林 長(zhǎng)春 130031）

目的 比較常壓柱色譜與快速制備色譜分離洋鐵酸模蒽醌成分純化程度。方法 常壓柱色譜柱采用硅膠（200～300目），流速15mL/min；快速制備色譜法柱采用FlashCS硅膠柱（柱規(guī)格40g），流速40mL/min。兩方法均以石油醚-乙酸乙酯為洗脫劑，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。結(jié)果 洋鐵酸模乙酸乙酯萃取物經(jīng)兩種色譜法分離后得到蒽醌類成分之大黃素，經(jīng)超高效液相分析，純度差異不大。常壓柱色譜中，分離過(guò)程溶劑經(jīng)洗脫再回收利用后消耗量大，耗時(shí)較長(zhǎng)。與快速制備色譜相比，該法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高。結(jié)論 快速制備色譜法可準(zhǔn)確、快速、高效分離洋鐵酸模蒽醌成分，適合在工作量較大的分離純化項(xiàng)目中應(yīng)用；但快速制備分離色譜通常難以勝任對(duì)藥物復(fù)雜體系如較多類物質(zhì)的分離。

洋鐵酸模；快速液相色譜法；大黃素

洋鐵酸模作為一種古老的中草藥，在民間應(yīng)用已有上千年的歷史，多采該藥治療皮膚疾患和止血[1-3]，臨床應(yīng)用比較廣泛[4]，有著確切療效。洋鐵酸模在我省廣泛分布，資源豐富。開(kāi)發(fā)潛力巨大，應(yīng)用前景廣闊。洋鐵酸模乙酸乙酯萃取物經(jīng)常壓柱色譜與快速制備色譜兩種色譜法分離后得到蒽醌類成分之大黃酚，經(jīng)超高效液相分析，純度差異不大。常壓柱色譜中，分離過(guò)程溶劑經(jīng)洗脫再回收利用后消耗量大，耗時(shí)較長(zhǎng)。與快速制備色譜相比，該法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高。結(jié)論：快速制備色譜法可準(zhǔn)確、快速、高效分離洋鐵酸模蒽醌成分，適合在工作量較大的分離純化項(xiàng)目中應(yīng)用。

1 儀器與試藥

Combiflash自動(dòng)快速制備色譜（Sq-16x），常壓柱（手動(dòng)裝柱硅膠柱），超高效液相色譜儀（waters UPLC）。

大黃素對(duì)照品（批號(hào)110756-200110，含量98.0%），洋鐵酸模根部粉末（采集于吉林），石油醚，乙酸乙酯，乙醇均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品與對(duì)照品溶液的制備

2.1.1 供試品溶液

洋鐵酸模藥材粗粉100g，乙酸乙酯回流提取兩次，每次2h，合并提取液，過(guò)濾，減壓回收乙酸乙酯；提取物選用D101型大孔樹(shù)脂柱層析達(dá)到初分離的目的，洗脫劑以30%乙醇、60%乙醇、90%乙醇進(jìn)行梯度洗脫。所得90%乙醇洗脫液，作為兩種柱色譜待分離的供試品液。

2.1.2 對(duì)照品溶液

精密稱取大黃素標(biāo)準(zhǔn)品適量，加甲醇溶解，制成1.00mg/mL的大黃素標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，備用。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

將90%乙醇洗脫液供試品液以干法上樣，以石油醚-乙酸乙酯不同比例進(jìn)行梯度洗脫。常壓柱色譜柱與快速制備色譜法柱各參數(shù)比較，見(jiàn)表1。

表1 常壓色譜法與快速制備色譜法比較

2.3 結(jié)果

2.3.1 色譜行為

常壓柱色譜洗下的洗脫液結(jié)合薄層色譜進(jìn)行檢識(shí)，將同-Rf值的斑點(diǎn)合并；快速制備色譜法采用軟件分析，直接將在254nm下有吸收的洗脫液按峰值合并。自動(dòng)快速色譜分離制備色譜中洗脫液按11～21號(hào)試管合并，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 自動(dòng)快速色譜分離制備色譜

2.3.2 方法學(xué)驗(yàn)證

經(jīng)兩種色譜方法處理所得洗脫液的合并液中，均得到與大黃素標(biāo)準(zhǔn)品Rf值一致的斑點(diǎn)，將此部分洗脫液回收溶劑后，利用超高效液相色譜儀分析分析其純度。色譜柱：ACQUITY UPLCTM BEH C18（1.7μm，2.1mm×50mm），流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸（60∶40）；流速：0.25mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm。

線性范圍和最低檢測(cè)限 分別吸取對(duì)照品溶液3、4、5、6、7、8、9μL注入超高效液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積積分值和保留時(shí)間，計(jì)算得大黃素回歸方程：y=6×106x-301050，r=0.9999，表明大黃素在0.09～0.27μg范圍內(nèi)與峰面積積分值具有良好的線性關(guān)系。

精密度：取對(duì)照品溶液2μL注入超高效相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣5次，RSD為0.41%。

重復(fù)性和溶液穩(wěn)定性 取常壓柱色譜所得大黃素供試品注入高效相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣5次，平均含量為104.5%，RSD為1.7%。另取常壓和快速制備液相色譜分別在室溫放置24h后測(cè)定。24h后主峰峰面積減失百分率＜2%，結(jié)果表明供試品溶液在24h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.4 樣品測(cè)定

分別取常壓柱色譜和快速制備色譜所得大黃素供試品，用超高效液相法測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，兩種色譜所得大黃素的含量結(jié)果相近。

3 討 論

在常壓柱色譜應(yīng)用中，樣品通常與硅膠的固體載體一起置于柱頂端。然后在柱頂端灌置溶劑（混合溶劑），依靠重力進(jìn)行溶劑洗脫。但此方法本身固有的缺點(diǎn)不可忽視：低柱效；收集組分耗時(shí)；對(duì)復(fù)雜樣品效果不好或需反復(fù)操作；柱間重現(xiàn)性不好；只限于等度或分階式洗脫；沒(méi)有在線監(jiān)測(cè)，只能手動(dòng)結(jié)合TLC薄層檢識(shí)。

而在快速色譜中，柱子是用更細(xì)的填料如硅膠填充，通常柱系統(tǒng)在中壓下運(yùn)行的分離效率更高。計(jì)量泵用于傳輸溶劑，取代正壓空氣驅(qū)動(dòng)；系統(tǒng)裝置在線檢測(cè)器及專用的組分收集器。我們只需借助功能鍵，純化就可開(kāi)始，組分將會(huì)得到只能化切分，分離過(guò)程十分省時(shí)。

本實(shí)驗(yàn)采用ISCO開(kāi)發(fā)出Combiflash?自動(dòng)快速色譜分離制備系列產(chǎn)品Sq-16x，其具有克自動(dòng)識(shí)別所裝色譜柱尺寸并自動(dòng)選擇最佳柱效的運(yùn)行程序；雙泵全梯度能力，梯度控制更加精確靈活，泵可與任何實(shí)驗(yàn)室用溶劑容器相連；實(shí)時(shí)的方法控制設(shè)定參數(shù)-包括形成曲線梯度用高通量。峰切割軟件得到純化化合物，當(dāng)化合物被檢測(cè)到未完時(shí)自動(dòng)運(yùn)行所有峰的擴(kuò)展收集等特點(diǎn)[5]。

傳統(tǒng)的柱色譜基本上是使用長(zhǎng)柱和常壓驅(qū)動(dòng)的色譜過(guò)程。分離效果對(duì)洗脫速度敏感，相對(duì)快的洗脫速度對(duì)于分離效果是有利的。隨著藥物研發(fā)和有機(jī)化學(xué)研究的發(fā)展，對(duì)通量的要求加大，而手動(dòng)操作的柱色譜不能滿足日益增加的純化要求，自動(dòng)快速色譜系統(tǒng)便成為解決純化瓶頸問(wèn)題的流行技術(shù)。但快速制備分離色譜通常難以勝任對(duì)藥物復(fù)雜體系如較多類物質(zhì)的分離。

[1] 國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1999: 708-721.

[2] 常新全,丁麗霞.中藥活性成分分析手冊(cè)[M].北京:學(xué)苑出版社,2001: 145-146.

[3] 祁紅.大黃素的抗炎作用[J].中草藥,1999,30(7):522.

[4] 周雄,宣利江,張書(shū)偉.中藥羊蹄的化學(xué)成分研究[J].中藥材,2005,28(2):104-105.

[5] Danielsen K,Eksenes DW,Francis GW.NMR study of some anthraquinones from Rhubarb[J].Magn Reson Chem,1992,30(3):395.

R914

B

1671-8194（2013）33-0052-02