Daxx-C626-740原核細胞表達載體的構建與誘導表達

李耀林周 藝，2何愛桃，2唐雙陽王 蓉萬艷平，*

（1 南華大學病原生物學研究所，湖南 衡陽 421001；2 南華大學公共衛生學院，湖南 衡陽 421001；3 南華大學護理學院，湖南 衡陽 421001）

Daxx-C626-740原核細胞表達載體的構建與誘導表達

李耀林1周 藝1，2何愛桃1，2唐雙陽1王 蓉3萬艷平1，3*

（1 南華大學病原生物學研究所，湖南 衡陽 421001；2 南華大學公共衛生學院，湖南 衡陽 421001；3 南華大學護理學院，湖南 衡陽 421001）

目的 為了研制Daxx-C抗體并觀察其在宮頸癌細胞中的應用效果，構建原核表達載體pET28a/DM626-740，將其在大腸桿菌中進行誘導表達，純化表達產物，鑒定其抗原性。方法 用PRIMER5.0軟件設計Daxx-C基因片段（氨基酸626-740）特異性引物，引入BamHI和SalI酶切位點，PCR擴增目的基因。將PCR產物連入載體pMD18-T，構建pMD18-T/DM626-740；然后，將BamHI和SalI酶切產物連入載體pET28a，經酶切鑒定及DNA序列分析后，構建原核表達載體pET28a/DM626-740。將其轉化E.coli BL21，IPTG誘導表達，利用Ni瓊脂糖凝膠層析柱純化表達產物，Western-blot檢測表達物與純產物。結果 雙酶切和DNA測序結果顯示，PCR正確擴增了Daxx-C基因片段并成功連入載體pET28a，構建了原核表達載體pET28a/DM626-740；該質粒在E.coli中誘導表達分子量約19kDa目的蛋白，且該蛋白能被抗Daxx抗體檢出。結論 構建的原核表達載體pET28a/DM626-740能在E.coli中表達目的的蛋白6His-DM626-740，并具有良好的抗原性。

Daxx；表達；純化；抗原性

20世紀90年代末期，Yang等[1]研究者發現了死亡結構域相關蛋白（death domain associate protein，Daxx）。Daxx是一種高度保守的蛋白質，具有多種生物學功能，由740個氨基酸組成，包括1個富含絲氨酸/脯氨酸/蘇氨酸（S/P/T）、1個富含酸性氨基酸和2個雙螺旋四個結構域，與Daxx發揮轉錄調控作用關系密切[2]。同時，Daxx定位與功能有關，它可定位到胞質、胞膜、核質、核仁和早幼粒細胞白血病蛋白（Promyelocyticleukemia protein，PML）核體（PML nuclear bodies，PML-NBs）等結構，從而發揮不同的效應。Daxx在某些因素影響下，通過修飾或是與其他蛋白質相互作用后在亞細胞區室之間發生轉位，影響細胞周期，發揮抗病毒、促凋亡或抗凋亡、以及轉錄調控等生物學作用[3]。在某些病毒感染的細胞內，病毒蛋白能與Daxx發生相互作用，破壞Daxx與PML共定位，從而使PML-NBs失去正常形態，如成散在的斑點狀。此時，PML-NBs將不能發揮抗感染作用，病毒處于潛伏感染狀態[4]。在全球女性惡性腫瘤中，宮頸癌的發病率僅僅少于乳腺癌，居第二位，且80%集中在發展中國家，并有年輕化的趨勢[5]。在宮頸癌組織中，99.7%以上可以發現有人乳頭瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）基因，它是致癌的關鍵因素。研究發現，HPV衣殼蛋白L2能誘導PML-NBs重組，增加Daxx的聚集，且與PML、Daxx發生共定位[6]。另外，HPVE1、E2、E5、E6、E7和L1均與PML-NBs有關系，PML-NBs很可能是HPV感染的始發部位[3]。因此，PML-NBs內的Daxx在細胞內防御病毒感染中具有非常重要的作用。本研究通過構建Daxx-C原核表達載體，誘導表達并純化產物Daxx-C，為進一步免疫小鼠制備特異性抗體，將抗體初步應用于宮頸癌組織或細胞，分析Daxx在細胞中的分布與定位奠定前期研究基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

本研究所保存有質粒pcDNA3.1（+）/Daxx[7]、菌株E.coli JM109及BL21；質粒抽提試劑盒和DNA純化回收試劑盒為Axygen公司產品，兔抗Daxx Ab為Santa Cruz公司產品，辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗鼠IgG抗體（二抗）為碧云天生物工程公司產品；Ni瓊脂糖凝膠層析柱系Sigma公司產品。

1.2 方法

1.2.1 載體的構建

根據Daxx全基因序列，運用Primer Premier5.0軟件設計Daxx-C626-740P1與P2引物，分別含BamHI或SalI雙酶切位點及相應保護性堿基。引物由上海invitrogen公司合成。引物序列為（下劃線GGATCC為BamHI酶切位點，GTCGAC為SalI酶切位點）：P1 TATGGATCCAT GGGTCCCCCCTGCAAAAAATCTG；P2 ACGCGTCGACCTAATCAG AGTCTGAGAGCACGATCTC。PCR擴增Daxx DM626-740片段。回收PCR產物后，將其連入載體pMD18-T，送南京金斯瑞公司進行DNA序列分析。將pET28a/DM626-740經BamHI和SalI雙酶切后，回收的小片段連入載體pET28a相同的位點，篩選陽性克隆，構建原核細胞表達載體pET28a/DM626-740，提質粒備用。

1.2.2 6His-DM626-740融合蛋白的誘導表達與純化

將質粒pET28a/DM626-740轉化E.coli BL21感受態細菌。挑取單個菌落，用5mL LB（含50μg/mL卡那霉素）于37℃培養4h，添加0.5mmol/L IPTG于37℃誘導表達5h；分別取800μL菌液于8000rpm離心5min，沉淀物用80μLPBS重懸；加入20μL上樣緩沖液混勻，取10μL進行SDS-PAGE（12%）。大批量誘導表達菌，離心收集菌體，用20mL的50mmol/L PBS（pH 7.4）懸浮后超聲破碎菌體（超聲3s，間隔5s，超聲破碎100次）；離心超聲后的菌體，包涵體用20mL的50mmol/L PBS重懸，上清和包涵體分別進行12%SDS-PAGE。將收集的上清液，用0.45μm濾膜過濾，濾過液過5mLNi瓊脂糖凝膠層析柱，按說明書洗脫并收集洗脫液，純化后樣品用20 mmol/L PBS（pH 7.4）緩沖液透析去除咪唑，冷凍干燥保存。12%SDS-PAGE檢測純化物。

1.2.3 6His-DM626-740融合蛋白抗原性檢測（Western blot）

將誘導表達6His-DM626-740蛋白的菌株培養物、轉膜，兔抗His單克隆抗體用含1%脫脂奶粉的PBS以1∶5000稀釋，將NC膜孵育其中，37℃，lh；將NC膜置于加入0.05%吐溫20的PBS中洗滌15min，每3min換1次液；同法將稀釋好的HRP標記的羊抗兔IgG與NC膜孵育，37℃，1h；將NC膜置于加入0.05%吐溫加的PBS中洗滌5min，每3min換1次液；將膜放在等體積比配制的ECL檢測試劑混合液中孵育約5min，在暗室中用X線曝光1min，顯影、定影、漂洗。

2 結 果

2.1 pET28a/DM626-740載體的構建

PCR擴增目的片段，連入載體pMD18-T，DAN測序結果完成正確后（結果未顯示），將其經BamHI和SalI雙酶切的小片段連入載體pET28a，篩選得到陽性克隆，其質粒作為模板進行PCR，獲得約350 bp的目的條帶，大小與預期相符（圖1 lane2）。將質粒用BamHI和SalI雙酶切得到約350 bp的小片段，大小與DM626-740一致（圖1 lane1），大片段與載體pET28a大小相符。

圖1 重組質粒pET28a/DM626-740PCR和酶切鑒定結果

2.2 融合蛋白6His-DM626-740的誘導表達與純化

誘導表達的菌液離心后重懸沉淀，12%SDS-PAGE結果見圖2。在分子量約19kDa處有表達產物（圖2 lane2～lane5），與預期6His-DM626-740蛋白質分子量一致。將上清液和包涵體進行12% SDSPAGE檢測，結果見圖3。融合蛋白6His-DM626-740主要以可溶性蛋白的形式存在于細胞破碎后的上清液中（圖3 lane2）。收集純化中每步的洗脫液、以及純化后的樣品用20mmol/L PBS（pH 7.4）緩沖液透析去除咪唑后，進行SDS-PAGE（12%）檢測，結果見圖4。

圖2 6His-DM626-740融合蛋白的誘導表達

圖3 6His-DM626-740融合蛋白表達部位鑒定

圖4 6His-DM626-740融合蛋白的純化與鑒定

2.3 融合蛋白6His-DM626-740的鑒定

Western blot檢測IPTG誘導菌及融合蛋白6His-DM626-740純化物，在19kDa 附近出現明顯的蛋白條帶，與預期融合蛋白6His-DM626-740分子量大小一致（圖5）；即所制備的融合蛋白作為抗原，能與抗Daxx抗體結合。

圖5 融合蛋白6His-DM626-740的Western blot分析

3 討 論

Daxx可能與病毒的感染、復制、增殖和細胞轉化存在密切的關聯[8]。在脾淋巴細胞，磷酸化的Daxx與PML結合發生相互作用，作為轉錄協同調節因子通過影響細胞基因的表達，從而促進細胞凋亡[9]。Daxx的4個結構域與Daxx的抗凋亡、促凋亡及轉錄調控等生物學功能密切相關。其中，DaxxC端是與其他蛋白質相互作用及其發揮功能的主要部位[2]，如漢坦病毒核衣殼蛋白可與DaxxC末端兩個富含賴氨酸部位結合，其中一個部位與Daxx核定位信號的基序重疊[10]。通過Daxx C末端雙螺旋結構域，HCMV UL82基因的表達產物pp71能直接結合Daxx，導致Daxx降解，抵消細胞內Daxx形成的免疫防御作用，從而有助于病毒IE基因的表達，提高病毒感染性，并且加速病毒的感染周期[11]。總之，Daxx C端可以作為抗原成分，用來制備與Daxx結合的相應特異性抗體。本研究構建了原核表達載體pET28a/DM626-740，并在E.coli中利用IPTG誘導表達了融合蛋白6His-DM626-740，將其純化得其純化物。通過Western blot方法，利用商用Daxx抗體能夠檢測到目的蛋白的表達，說明6His-DM626-740蛋白能夠與抗Daxx抗體產生特異性結合反應。最近，有研究者在呼腸病毒感染的腦組織，發現通過IFN-I機制上調Daxx，可能依賴Daxx定位胞質或胞核而在細胞凋亡中發揮作用[12]，說明Daxx定位與病毒感染后宿主細胞凋亡作用有關。總之，為了觀察在HPV16致宮頸癌進程中Daxx在細胞內位置的變化，接下來課題組會將純化的融合蛋白6His-DM626-740免疫小鼠，制備抗Daxx-C抗血清并進行純化，通過免疫組化技術，將其初步應用于宮頸癌組織或宮頸癌細胞，進一步確定相應抗體的特異性。

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Construction and Induced Expression of Prokaryotic Expression Vector of Daxx-C626-740

LI Yao-lin1, ZHOU Yi1,2, HE Ai-tao1,2, TANG Shuang-yang1, WANG Rong3, WAN Yan-ping1,3*
(1 Institute of Pathogenic Biology, University of South China, Hengyang 421001, China; 2 School of Public Health, Nanhua University, Hengyang 421001,China; 3 College of Nursing, Nanhua University, Hengyang 421001, China)

Objective To prepare Daxx-C antibody and study its used effect on the cervical carcinoma, prokaryotic expression vector of Daxx-C626-740 was constructed and transformed into E.coli, and antigenicity of Daxx-C626-740 purified production was identified. Methods The specific primers of Daxx gene fragment(amino acids 626-740)including BamHI and SalI enzyme sites were esigned by software PRIMER5.0. PCR amplification products were inserted into MD18-T, and the vector of pMD18-T/DM626-740 was constructed. Then, DM626-740 gene fragments from pMD18-T/DM626-740 digested with BamHI and SalI were inserted into pET28a. The prokaryotic expression vector of pET28a/DM626-740 was constructed by identification of enzyme digestion and DNA sequence. The plasmid of pET28a/DM626-740 was transformed into E. coli BL21. The expression productions were induced with IPTG and purified by Ni-NTA kit. Western bolt was used to analyze expression and purification productions. Results The enzyme digestion and DNA sequencing results showed that Daxx gene fragment(626-740 amino acid residues)was correctly inserted into pET28a. The vector of prokaryotic expression vector of pET28a/DM626-740 was constructed. Conclusion The prokaryotic expression vector of pET28a/DM626-740 constructed can express the aim protein of 6His-DM626-740.The fusion protein of 6His-DM626-740 showed Daxx antigenicity.

Daxx; Expression; Purification; Antigenicity

R373

B

1671-8194（2013）35-0001-03

湖南省教育廳重點項目（11A102）；湖南省教育廳一般項目（12C0337）；衡陽市科技局項目（2011KJ2）

*通訊作者：E-mail： 365054993@qq.com