鎂合金涂覆不同濃度硅-羥基磷酸鈣后的體外生物相容性評(píng)價(jià)

張柱武 潘 鋒

（本溪市衛(wèi)生學(xué)校，遼寧 本溪 117022）

鎂合金涂覆不同濃度硅-羥基磷酸鈣后的體外生物相容性評(píng)價(jià)

張柱武 潘 鋒

（本溪市衛(wèi)生學(xué)校，遼寧 本溪 117022）

目的利用大鼠成骨細(xì)胞在體外評(píng)價(jià)使用硅-羥基磷酸鈣涂覆的鎂合金的毒性反應(yīng)。方法利用大鼠顱骨培養(yǎng)第三代成骨細(xì)胞，之后與二種覆有不同硅-羥基磷酸鈣涂層的鎂合金進(jìn)行共培養(yǎng)，之后通過細(xì)胞活力檢測(cè)、堿性磷酸酶檢測(cè)、掃描電鏡觀察評(píng)估細(xì)胞生長(zhǎng)情況。結(jié)果細(xì)胞活力檢測(cè)和堿性磷酸酶檢測(cè)表明，第一種硅（12%）-羥基磷酸鈣涂覆的鎂合金利于成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)；掃描電鏡下可見成骨細(xì)胞在第一種硅（12%）-羥基磷酸鈣涂層表面的鎂合金生長(zhǎng)均勻，增殖明顯。結(jié)論硅含量在12%的硅-羥基磷酸鈣涂層利于成骨細(xì)胞的體外黏附和生長(zhǎng)。

成骨細(xì)胞；鎂合金；硅-羥基磷酸鈣

臨床上發(fā)現(xiàn)鈦合金、不銹鋼制作的骨釘和骨板存在著“應(yīng)力屏”現(xiàn)象，且需要二次手術(shù)取出固定物[1]。鎂合金制作的骨科固定物具有降解性，表現(xiàn)越來越多的優(yōu)點(diǎn)[2]。因此，鎂合金具有很大的潛力取代鈦合金和不銹鋼 。目前鎂合金在動(dòng)物體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)僅發(fā)現(xiàn)皮下可產(chǎn)生局部微小氣泡。如能對(duì)其改性使其更加完美。本研究在鎂合金表面涂覆兩種不同硅含量（12%和20%）的羥基磷酸鈣，檢測(cè)其在體外與成骨細(xì)胞的相容性問題。

1 材料與方法

1.1 合金制備

在99%CO2和1%SF6（六氟化硫）氣體保護(hù)下，將電阻爐上里面的熔煉溫度控制在800±50℃以內(nèi)。按質(zhì)量百分比，合金采用99.99%純鎂、99.99%純鋅、化學(xué)純MnCl2和金屬鈣熔配，將熔煉后的合金在金屬模中鑄造成型。上述方法所制備出來的Mg-Mn-Zn的重量百分比分別為：Mn為1.2%，Zn為1.0%，余者為Mg[3]。

1.2 涂層制備

對(duì)加工好的圓盤形鎂合金使用Ca（OH）2和NaOH進(jìn)行處理，再做熱處理，用預(yù)配好硅-羥基磷灰石仿生溶液（在仿生溶液中加入不同比例的SiO32-溶液調(diào)節(jié)硅濃度）浸泡，之后使用熱處理制備出12%和20%硅濃度的不同的硅-羥基磷酸鈣涂覆層[4]。將上述兩組涂覆層用紫外線照射消毒。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及其鑒定

取SD乳鼠（SPF級(jí)，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部）置入75%酒精消毒后剪開乳鼠頭部皮膚暴露顱骨并剔除其上附著的軟組織及骨膜，剪下顱骨后用PBS清洗數(shù)次放入培養(yǎng)皿中剪碎，再置入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中用0.25%胰蛋白酶消化5min。之后再加入0.1% I型膠原酶繼續(xù)消化，每隔15min收集一次消化液，最后將收集到的所有消化液放入離心管中1000rpm離心5min，棄上清，用培養(yǎng)液將沉淀吹打后加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，接種在50mL培養(yǎng)瓶中。取培養(yǎng)第3代細(xì)胞并按照1×105/mL接種于6孔培養(yǎng)板中（每孔均加入蓋玻片），待細(xì)胞爬片后，取出蓋玻片并用PBS沖洗，之后10%福爾馬林固定，茜素紅S染液染色5min，丙酮二甲苯混合液沖洗，顯微鏡下觀察。取出已爬有細(xì)胞的蓋玻片，加兔抗大鼠I型膠原抗體 （武漢博士德），37℃孵育1h，再加Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG（武漢博士德），37℃孵育1h，PBS沖洗3次，加入4'，6-二脒基-2-苯基吲哚復(fù)染細(xì)胞核，熒光顯微鏡下觀察。

1.4 掃描電鏡觀察

取第3代成骨細(xì)胞按2×105/mL接種于各組合金表面，放入37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)6、12、24h后取出，PBS清洗后戊二醛固定24h，梯度酒精脫水、CO2臨界點(diǎn)干燥并噴金后，SSX-550掃描電子顯微鏡觀察。

1.5 細(xì)胞活力檢測(cè)

將各合金組按3cm2/mL（表面積/浸提介質(zhì)）制備高糖DMEM浸提液，之后使用浸提液培養(yǎng)接種于96孔培養(yǎng)板中的成骨細(xì)胞，接種濃度為1×104/mL，對(duì)照組為DMEM培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)12、24、48h后棄掉液體加入5mg/mL的3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽20μl，4h后PBS清洗，加入120μl二甲基亞砜，震蕩溶解1min，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值。

1.6 堿性磷酸酶檢測(cè)

使用1.5步驟制備的浸提液培養(yǎng)接種于6孔培養(yǎng)板中的成骨細(xì)胞，接種濃度為1×105/mL，對(duì)照組為DMEM培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)12、24、48h后吹打消化，超聲粉碎，用堿性磷酸酶活度試劑盒（昊柏生物科技有限公司）檢測(cè)細(xì)胞的ALP活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)全用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用多因素方差分析。數(shù)據(jù)處理過程用SPSS16.0軟件完成。

2 結(jié) 果

2.1 成骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察和鑒定

倒置顯微鏡觀察見原代培養(yǎng)24h出現(xiàn)貼壁細(xì)胞，48h出現(xiàn)集落樣生長(zhǎng)的細(xì)胞，傳代后細(xì)胞多呈梭形或多角形，多突起，核橢圓, 核仁多而明顯。熒光顯微鏡觀察見紅色熒光分布于細(xì)胞胞漿，藍(lán)色熒光分布于細(xì)胞核，正置顯微鏡觀察則見有被茜素紅染為紅色的礦化結(jié)節(jié)存在。

2.2 掃描電鏡觀察

掃描電鏡觀察可見：在培養(yǎng)6、12、24h，含硅12%涂覆層表面有明顯細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞分布均一，細(xì)胞形態(tài)多鋪展為梭形或多角形陰影；含硅20%涂覆層表面細(xì)胞生長(zhǎng)不甚明顯，培養(yǎng)12及24h后，細(xì)胞突起明顯減少，特別是在培養(yǎng)24h后，細(xì)胞突起明顯回縮，不能很好黏附。

2.3 細(xì)胞活力

含硅12%涂覆層OD值隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，至48h以后，呈平緩趨勢(shì)；含硅20%涂覆層OD值隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而呈明顯下降趨勢(shì)，兩組之間差異明顯（P＜0.05）（圖1）。

2.4 ALP活性

浸提液培養(yǎng)12h，兩組之間均沒有差異（P＞0.05）；在培養(yǎng)24h后，含硅12%涂覆層的ALP活性明顯高于含硅20%涂覆層，存在顯著性差異（P＜0.01）（圖2）。

3 討 論

圖1

圖2

鎂合金在人體內(nèi)釋放出的鎂離子有益于人體的各種需要[10]。但沒有涂層的鎂合金在體內(nèi)的過快降解不利于對(duì)骨的固定。因此，在鎂合金表面涂覆一定的防止過快收到體液侵蝕的物質(zhì)顯得非常必要。硅-羥基磷酸鈣復(fù)合物和含硅-磷酸鈣復(fù)合物均是較好的防侵蝕材料[11]，有研?究表明，硅能夠影響成骨細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)，這樣硅也就間接地影響了骨的生長(zhǎng)和發(fā)育。人體骨中正常的硅含量為100ppm。這說明硅在骨的正常形成過程中有非常重要作用。因此，采實(shí)驗(yàn)采用了用硅-羥基磷酸鈣涂覆鎂合金來獲得最佳的可植入體內(nèi)的涂層。實(shí)驗(yàn)中掃描電鏡觀察和細(xì)胞活力測(cè)試都表明涂覆12%硅-羥基磷酸鈣的鎂合金能夠很好地促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。所用Mg-Mn-Zn合金并不含有有毒的金屬鋁成分。已經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證明：Mn參與體內(nèi)多種酶的活動(dòng)，是酶的激活劑，并能促進(jìn)新陳代謝，合金中的Mn含量為1.2%，其降解過程不會(huì)危及細(xì)胞的生存；Zn則可增強(qiáng)人體免疫功能，更是維持生命正常活動(dòng)的關(guān)鍵因素，合金中的Zn含量為1.0%，對(duì)人體也不會(huì)造成損害；Mg在合金中占有的比重比較大，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)鎂在維持心臟、神經(jīng)、肌肉的正常功能有重要作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了含12%硅-羥基磷酸鈣的良好生物相容性，但還需要進(jìn)一步地研究涂覆層的最佳厚度問題，這需要在制作工藝過程中，把握好仿生液與鎂合金的反應(yīng)時(shí)間問題。如果在相容性和防侵蝕涂層厚度上，都能很好地找出相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，將可很好地解決裸鎂合金在體內(nèi)的過快降解問題，制作出一種既能降解又能免除二次手術(shù)的骨科固定材料。

[1] 劉振東,范清宇.應(yīng)力遮擋效應(yīng)-尋找丟失的鑰匙[J].中華創(chuàng)傷骨科雜志,2002,4(1):62.

[2] Kim SR,Lee JH,Kim YT,et al.Synthesisi of Si,Mg substituted hydroxypatatites and their sintering behaviors[J].Biomaterials,20 03,24(5):1389-1398.

[3] 張二林,楊磊,杜輝,等.醫(yī)用可吸收Mg-Mn-Zn-Ca鎂合金[P].中國(guó):200810012384.3.2010-01-20.

[4] 張二林,周鶉?guó)Q,楊柯.一種制備含硅羥基磷酸鈣涂層的仿生溶液及仿生方法[P].中國(guó):200810012661.0.2010-02-10.

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1671-8194（2013）15-0104-02