重組人角質細胞生長因子-1突變體表達載體的構建

趙 雪 麻馨月

（吉林農業科技學院，吉林 吉林，132101）

重組人角質細胞生長因子-1突變體表達載體的構建

趙 雪 麻馨月

（吉林農業科技學院，吉林 吉林，132101）

目的構建重組人角質細胞生長因子-1突變體的表達載體。方法采用PCR突變方法，將rhKGF cDNA第40位的Cys密碼子突變為Ser密碼子，所得的突變片斷插入表達載體的表達框架中。結果DNA測序分別證實合成的基因序列克隆入pET-22b中。結論構建重組人角質細胞生長因子-1突變體的表達載體，得到突變體蛋白40位絲氨酸突變截短型角質細胞生長因子[Ser40]rhKGFdest-23。

重組人角質細胞生長因子；突變體

角質細胞生長因子（Keratinocyte Growth Factor）是成纖維細胞生長因子家族的一員，它通過與受體（KGFR）的結合，特異性地刺激上皮細胞的增殖，對皮膚、胃、腸、腎、膀胱、肺等上皮的損傷有修復作用，能減少放化療所帶來的副作用。KGF能特異性作用于上皮細胞，而不作用于成纖維細胞和內皮細胞。試驗表明，KGF 能加速傷口的重新上皮化[1]、促進角膜上皮損傷修復[2-6]細胞的損傷[7]，且在燒傷、潰瘍以及切割傷的修復和再生方面有顯著作用[8，9]。而N端前23位氨基酸殘基缺失后的截短型KGF（KGFdes1-23）具有更高的穩定性和活性。KGF是成纖維細胞生長因子-7的肝素結合性家族的一員[10]。

本試驗中重組人角質細胞生長因子（rhKGF），是一種通過DNA重組技術在大腸桿菌生產的重組人源蛋白。為了增加蛋白質的穩定性，在去除了內源性角質細胞生長因子N-端的前23個氨基酸，但不影響KGF對上皮細胞的促有絲分裂活性基礎上，對40位游離的半胱氨酸進行絲氨酸突變，以期獲得穩定性更好，表達量更高的40位絲氨酸突變截短型角質細胞生長因子[Ser40]rhKGFdest-23突變體蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料

限制性內切酶，DNA連接試劑盒，質粒小提試劑盒，DNA凝膠回收試劑盒，DNA Marker均購自Takara公司；Yeast Extract，Typton均購自OXOID；Pyrobest DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶，限制性內切酶NdeⅠ、BamHⅠ，T4DNA連接酶，Agarose購自寶生物工程（大連）有限公司；PCR引物由上海生物工程有限公司合成；表達載體pET-22b，hKGF由暨南大學醫藥生物技術研究開發中心提供。

1.2 方法

1.2.1 rhKGF1dest23基因片段的合成

設計[Ser40]rhKGF1dest23的兩端物，上游引物：5’-GGAATTCCATA TGAGCTATGATTAT-3’（劃線部分為NdeⅠ酶切位點）；下游引物：5’-CGGGGATCCTTATCACGTAATGGCC-3’（劃線部分為BamHⅠ酶切位點）。以pET22b-[Ser40]rhKGF1為模板擴增[Ser40]rhKGF1dest-23，經94 ℃變性3min進入循環，然后72℃延伸5min，反應產物經1%的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。把回收產物命名為[Ser40]rhKGFdest-23。它的5’端有NdeⅠ酶切位點，3’端有Bam HⅠ酶切位點。

1.2.2 重組表達制粒pET22b-[Ser40]rhKGFdest-23的構建

重組表達質粒pET22b-[Ser40]rhKGF1dest-23用NdeⅠ和BamHⅠ37℃雙酶切4h，切膠回收后，在SolutionⅠ連接酶的作用下，16℃連接3h后轉入感受態DH5α細胞中，轉化菌涂布在含100mg/L Amp平板上，菌落PCR為陽性的克隆菌，測序。

1.2.3 陽性菌落的鑒定

酶切完畢后，用PCR Product Purification Kit V3.0進行回收。挑選幾個經菌落PCR鑒定呈陽性的轉化子，接種到5mL含100μg/mL的氨芐青霉素的LB培養基中，37℃、220rpm過夜培養，50%甘油保種。取適量甘油菌測序，序列測定由上海生物工程有限公司完成。

2 結 果

2.1 [Ser40]hKGF1dest23DNA片段的合成，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約為440 bp的DNA片段(圖1)，與預期DNA片段大小一致，表明已經成功獲得[Ser40]rhKGF1dest23基因。

2.2 轉化子的陽性鑒定

通過42℃熱激法將pET22b-[Ser40]rhKGFdest-23重組質粒的構建和序列分析，連接產物轉入感受態DH5α中，進行菌落PCR鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約440 bp見[Ser40]rhKGF1dest23目地條帶，與理論預期值大小基本一致（圖2），表明已成功構建重組表達載體，重組表達質粒經北京三博遠志生物工程有限公司測序，DNA序列分析確證已成功引入突變，結果與預期相符（圖3）。

圖1 上、下游引物及突變體[Ser40]rhKGFdest-23基因片段

圖2 含[Ser40]rhKGF1dest23重組轉化子的菌落PCR陽性鑒定

3 討 論

圖3 重組載體DNA序列分析

FGF家族對內皮細胞，成纖維細胞與上皮細胞具有促細胞增殖與分化的功能，而KGF專一性的與上皮細胞的FGFRIIIb型受體特異結合，所以安全性較好。根據《Protein Science》上的基因結構分析，知h-KGF的40位Cys暴露在分子的表面，易氧化，從而引起h-KGF蛋白質結構的不穩定。本實驗通過將重組角質細胞生長因子-1暴露在分子表面，易引起蛋白不穩定的第40位半胱氨酸突變為絲氨酸，使其蛋白結構穩定。為下一步的突變體蛋白的穩定性研究奠定基礎。

[1] Pierce GF,Yanagihara D,Klopchin K,et al.Stimulation of all epithelial elements during skin regeneration by keratinocyte growth factor [J].Exp Med,1994,179(3):831-840.

[2] 錢中武,龔向明.角質細胞生長因子促進角膜上皮損傷修復的研究[J].中華眼科雜志,1998,34(1):15-18.

[3] Jiro I,Kenji K.Growth factor: important in wound healing and maintenance of transparency of the cornea[J].Prog Retinal Eye Res,2000,19(1):113-129.

[4] 黃新強,宋思揚.角質細胞生長因子研究進展[J].生物化學與生物物理進展,2001,28(4):459-462.

[5] Housley RM,Morris CF,Boyle W,et al.Keratinocyte growth factor induced proliferation of hepatocytes and epithelial cells throughout the rat gastrointestinal tract[J].Clin Invest,1994,94(2): 764-777.

[6] Mart I,Makar Y,Ferguso N,et al.Transfection with keratinocyte growth factor 1 cDNA with electroporation improves wound healing in an aged mouse model[J].J Surg Res,2004,21(2):320-321.

[7] 王小華,周舟,朱光旭等.角質細胞生長因子對腸上皮細胞輻射損傷的防護作用[J].第三軍醫大學學報,2000,22(8):713-716.

[8] Xia YP,Zhao Y,Marcus J,et al.Effects of keratinocyte growth factor on wound healing in an ischaemia- impairedrabbits ear model and scar formation[J].Pathol,1999,18(4):431-438.

[9] Smith PD,Polo M,Soler PM,et al.Efficacy of growth factors in the accelerated closure of interstices in explanted meshed human skin grafts[J].J Burn Care Rehabil,2000,21(1):5-9.

[10] Rubin JS,Bottaro DB,Chedid M,et al.Keratinocyte growth factor [J].Cell Biol Int.,1995,19(6):399-411.

Q507

B

1671-8194（2013）15-0091-02

吉林農業科技學院青年教師科研基金資助項目