PDI單抗對創傷性深靜脈血栓形成大鼠體內組織因子活性的影響

王勝權楊 濤 曹文東 續慧民 皮興濤 郝 斌*

（山西醫科大學附屬山西大醫院血管外科，山西 太原 030032）

PDI單抗對創傷性深靜脈血栓形成大鼠體內組織因子活性的影響

王勝權△楊 濤 曹文東 續慧民 皮興濤 郝 斌*

（山西醫科大學附屬山西大醫院血管外科，山西 太原 030032）

目的觀察PDI（protein disulfide isomerase 蛋白質二硫鍵異構酶）單抗對創傷性深靜脈血栓形成大鼠體內組織因子（tissue factor TF）活性的影響，初步探討PDI蛋白在組織因子活化中的作用。方法選擇SD大鼠40只，隨機平均分為實驗組和對照組。實驗組大鼠預先注射PDI單抗，對照組不加干預。鉗夾法損傷實驗組和對照組大鼠的右股靜脈，制造大鼠創傷性深靜脈血栓模型，造模后立即抽血，抗體夾心酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測大鼠體內TF含量，發色底物法檢測TF促凝活性，并于第3、10、25h分別抽血，利用ELISA法檢測大鼠體內D-二聚體含量，25h后解剖大鼠右股靜脈觀察血栓形成情況。結果對照組大鼠血清中TF含量及活性均高于實驗組（P＜0.01），3次抽血實驗組大鼠血D-二聚體含量無明顯變化，對照組大鼠成增高趨勢，解剖后發現實驗組大鼠股靜脈血栓形成范圍、栓子大小及患肢腫脹程度均小于對照組。結論PDI單抗可以抑制大鼠創傷性深靜脈血栓的形成，PDI蛋白在組織因子活化的活化過程起重要作用。

創傷性深靜脈血栓形成；PDI；組織因子

近年來，血栓性疾病因其高發病、高危害和治療的高花費越來越受到人們的重視，它遍布臨床各個科室，是臨床醫師比較棘手的疾病之一，而由于手術、外傷等創傷性原因造成的創傷性深靜脈血栓形成的發病率更是逐年增高。現代凝血理論已經證實TF是生理性凝血級聯反應的主要啟動因子[1]，但是其活化的具體分子學機制尚未明確。Ruf等研究發現：暴露于細胞便表面的TF的促凝活性其實是很低的，其表面含有一個暴露的二硫鍵，只有當這一個二硫鍵轉變為巰基以后才能形成完全有活性的TF，進而發揮其外源性凝血途徑啟動子的作用[2]。PDI蛋白是一種廣泛存在于真核細胞的氧化還原蛋白家族，具有氧化還原酶、異構酶及分子伴侶的作用，能夠催化二硫鍵與巰基之間的互變反應。因而本實驗利用PDI單抗作用于大鼠創傷性深靜脈血栓模型，觀察PDI單抗對大鼠創傷性深靜脈血栓形成的影響，初步探討PDI蛋白在TF活化過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SD大鼠40只，均為雌性，體質量300g左右，山西醫科大學實驗動物中心提供；PDI單抗，美國BD公司產品；大鼠組織因子ELISA試劑盒，山西博士德公司提供；大鼠組織因子發色底物試劑盒，法國HYPHEN Bio Med公司產品，大鼠D-二聚體ELISA試劑盒購自上海裕平生物科技有限公司。

1.2 方法

①SD大鼠40只，隨機平均分為實驗組和對照組，實驗組大鼠預先注射PDI單抗（50μg/只）[3]，對照組大鼠預先不做任何處理。②造模：將大鼠麻妥，固定，消毒后行右腹股溝處內側切口，長約1cm，暴露出股動、靜脈及股神經，顯露出長約1.5cm的股靜脈，用12.5cm全齒蚊式血管鉗鉗夾1次，力量為血管鉗緊1扣，每次持續3s，用1號絲線全層間斷縫合皮膚切口，不放置引流，術后行髖人字石膏固定[4]。③造模后立即經大鼠尾靜脈取血2mL于兩個枸櫞酸三鈉抗凝管中（各1mL，抗凝劑：全血為1∶9），在室溫下以3500r/min離心6min，取上層血清，-80℃條件下冷藏待用。④采用ELISA法檢測各組大鼠靜脈血中組織因子濃度，發色底物法檢測各組大鼠靜脈血中組織因子促凝活性，均嚴格按照試劑盒說明書進行。⑤相關文獻及我們的預實驗都表明，造模后3h開始有血栓形成，25h血栓形成達到高峰，因此，于術后5、10、25h經大鼠尾靜脈采血，ELISA法檢測兩組大鼠體內D-二聚體的含量。⑥25h后解剖大鼠患肢，切除股靜脈，觀察血栓形成情況。

1.3 統計學方法

應用SPSS 13.0軟件，TF濃度和活性比較采用獨立樣本的t檢驗，D-二聚體的變化采用重復測量進行比較。數據以均數±標準差（χ—± s）表示，以P＜0.05為差異有統計學意義 。

2 結 果

2.1 兩組大鼠TF含量及濃度變化

對照組大鼠血清中TF含量及活性均高于實驗組（P＜0.01）。見表1。

表1 兩組大鼠TF濃度及活性變化(χ—±s)

2.2 兩組大鼠體內D-二聚體含量變化

對照組大鼠體內D-二聚體含量成逐漸增高趨勢，實驗組大鼠體內D-二聚體含量較低，無明顯增高趨勢。見圖1。

圖1

2.3 25h后，解剖大鼠患肢，取出大鼠股靜脈，發現實驗組大鼠股靜脈形成的例數及栓子大小、長度均小于對照組，根據栓子長度，將血栓分為無血栓，原位血栓及蔓延血栓3種情況，無肉眼可見血栓為無血栓，2mm以內的為局部血栓，＞2mm的為蔓延血栓。具體結果見表2。

表2 兩組大鼠血栓形成情況(只)

3 討 論

組織因子是一種由263個氨基酸殘基組成，相對分子質量為47000的單鏈跨膜糖蛋白，由血管內皮細胞、單核細胞、平滑肌細胞等多種細胞合成，作為一種膜受體，其細胞外部分是激活凝血系統所必需的。TF是外源性凝血途徑的啟動因子，當其與FVIIα結合生成復合物激活凝血因子X，從而啟動凝血反應，導致病理性血栓的形成[5]。一旦形成血栓，就會同時激活機體的纖溶系統使血栓溶解，產生分子大小、結構不同的降解產物，其中D-二聚體為纖維蛋白原特異性降解終產物。血漿D-二聚體水平的升高，表明體內已有血栓形成，并且已發生了降解[6]。而正常情況下，血管內皮細胞并不表達TF，故健康人血漿中TF含量極低[7]。當血管內皮功能失衡或血管內存在刺激血管內皮細胞表達TF的因素時，就有可能啟動凝血過程。我們的預實驗也表明損傷大鼠股靜脈內皮細胞，造成TF暴露后可導致大鼠創傷性深靜脈血栓的形成，故抑制血管內皮細胞表達TF已成為抗血栓形成的主要手段。

PDI蛋白家族是一類在內質網中起作用的巰基-二硫鍵氧化還原酶。它們通常含有CXXC（Cys-Xaa-Xaa-Cys，CXXC）活性位點，活性位點的兩個半胱氨酸殘基可催化底物二硫鍵的形成、異構及還原。所有PDI家族成員包含至少一個約100個氨基酸殘基的硫氧還蛋白同源結構域。PDI家族的主要職能是催化內質網中新生肽鏈的氧化折疊，另外在內質網相關的蛋白質降解途徑（ERAD）、蛋白質轉運、鈣穩態、抗原提呈及病毒入侵等方面也起重要作用[8]。由于PDI蛋白能夠催化二硫鍵與巰基之間的互變反應，且能催化內質網中大部分新生肽鏈的氧化折疊，因而設想通過一些實驗來驗證其是否在TF的活化過程中起作用。

本實驗結果顯示，PDI抗體預先干預的大鼠在血管被損傷后形成血栓的概率或程度明顯小于空白對照組大鼠。通過該實驗，我們可以認為PDI蛋白參與了TF的活化過程，抑制PDI蛋白就可以抑制TF的促凝活性，減少血栓形成。PDI蛋白可以作為將來新的抗凝藥物的研究靶點，為新的抗栓藥物的研制提供理論幫助。

[1] 門劍龍,任靜.組織因子在血栓形成機制中的研究進展[J].天津醫藥,2012,40(10):1078-1081.

[2] Ruf W.Role of thiol pathways in TF procoagulant regulation[J]. Thromb Res,2012,129(12): S11-S12.

[3] Furlan-Freguia C.P2X7 receptor signaling contributes to tissue factor-dependent thrombosis in mice[J].J Clin Invest,2011,121(7): 2932-2944.

[4] 王兵.大鼠急性創傷性深靜脈血栓模型建立及股靜脈基因表達研究[D].昆明:昆明醫學院,2005.

[5] 劉曉勤,王蕾.組織因子在血栓形成中的作用[J].國外醫學:腦血管疾病分冊,1999,7(4): 215-217.

[6] Lowe GD.How to search for the role and prevalence of defective fibrinolytic states as triggers of myocardial infarction:The haemostasis epidemiologists view[J].Ital Heart J,2001,2(9):656-657.

[7] 曹文東,楊濤.染料木黃酮對高同型半胱氨酸誘導的人血管內皮細胞組織因子表達的干預作用[J].中國藥物與臨床,2010, 10(6):612-614.

[8] 王志強,周智敏,郭占云.蛋白質二硫鍵異構酶家族的結構與功能[J].生命科學研究,2009, 13(6):548-553.

PDI Monoclonal Antibody Have Influence on the Activity of Tissue Factor Which Exist in the Rats that Get Traumatic Deep Venous Thrombosis

WANG Sheng-quan,YANG Tao,CAO Wen-dong,XU Hui-min,PI Xing-tao,HAO Bin

(Department of Vascular Surgery, Shanxi Dayi Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030032, China)

[Abstrct] ObjectiveObserve the influence of PDI monoclonal antibody on the activity of tissue factor which exist in the rats that get traumatic deep venous thrombosis , explore the role of PDI protein in tissue factor activation.Mothods40 SD rats were randomly divided into experimental and control groups, the experimental rats pre-injection PDI mAb, control group without intervention. Forceps injury the right femoral vein of rats, both experimental and control groups, manufacturing traumatic deep vein thrombosis model, blood immediately after modeling, antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay detection rats TF content, chromogenic substrate assay TF procoagulant activity, At 3, 10 and 25hour respectively for blood, rats measured by ELISA D-dimer. Anatomical rat right femoral vein observed thrombus formation after 120h.ResultsTF content and activity of the experimental group were higher than in the control group serum(P＜0.01), D-dimer of experimental rats showed no significant change, The control group of rats into the trend of increasing, anatomical found that the range of experimental rats femoral vein thrombosis, embolus size and degree of limb swelling is less than the control group.ConclusionPDI monoclonal antibody can inhibit the formation of deep vein thrombosis in rats with traumatic,PDI protein plays an important role in the tissue factor activation of the activation process.

Traumatic deep vein thrombosis; Protein disulfide isomerase; Tissue factor

R543

B

1671-8194（2013）15-0071-02

△在讀研究生

*通訊作者：E-mail： tao55555@sina.com