5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質(zhì)體對(duì)人鼻咽癌HNE-1細(xì)胞株增殖抑制與凋亡作用的影響

林 力 鄧 碧*

（重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院，重慶 401120）

5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質(zhì)體對(duì)人鼻咽癌HNE-1細(xì)胞株增殖抑制與凋亡作用的影響

林 力 鄧 碧*

（重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院，重慶 401120）

目的 研究5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質(zhì)體對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞株HNE-1細(xì)胞株增殖與凋亡作用的影響。方法 本研究以人鼻咽癌HNE-1細(xì)胞株為研究對(duì)象，以5-氟尿嘧啶為對(duì)照，用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法測(cè)定5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質(zhì)體對(duì)HNE-1細(xì)胞的增殖抑制率；用流式細(xì)胞儀（FCM）測(cè)定5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質(zhì)體作用與HNE-1細(xì)胞72h后細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果 5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質(zhì)體對(duì)HNE-1細(xì)胞的IC50是5-氟尿嘧啶的1/3；濃度為0.043μg/mL 5-氟尿嘧啶和5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質(zhì)體作用于HNE-1細(xì)胞的凋亡指數(shù)分別為（6.31±0.17）%、（19.53±1.79）%。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)研究顯示，與5-氟尿嘧啶相比較，5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質(zhì)體對(duì)人鼻咽癌HNE-1細(xì)胞具有很好的生長(zhǎng)增殖抑制作用，并且能夠顯著提高HNE-1細(xì)胞的凋亡率。

5-FUR前藥脂質(zhì)體；HNE-1；細(xì)胞凋亡

鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）作為我國(guó)南方常見的頭頸部惡性腫瘤之一，目前治療方案早期以放射治療為主，而中晚期則以化療為主[1]。氟尿嘧啶是臨床常用于治療鼻咽癌的化療藥物，但其對(duì)正常組織細(xì)胞的毒性大，長(zhǎng)期使用會(huì)嚴(yán)重?fù)p害機(jī)體的各器官組織和免疫系統(tǒng)的功能。為避免或減輕氟尿嘧啶的不良反應(yīng)，國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者開展了氟尿嘧啶新劑型的研究工作[2]。5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質(zhì)體（5-fluorouridine prodrug liposome）是氟尿嘧啶類抗腫瘤藥物的新劑型之一，但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質(zhì)體抗腫瘤作用的研究較少。本實(shí)驗(yàn)擬從細(xì)胞增殖抑制及細(xì)胞凋亡這兩方面研究5-FUR前藥脂質(zhì)體對(duì)人鼻咽癌HNE-1 細(xì)胞株的抗腫瘤作用，為5-FUR前藥脂質(zhì)體抗腫瘤作用的臨床應(yīng)用作一初探。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系：人鼻咽癌HNE-1細(xì)胞株（購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究所）。

1.1.2 試劑和儀器：RPMI-1640購(gòu)于Gibco公司，新生牛血清（杭州四季清公司），四甲基偶氮唑鹽（MTT），二甲亞砜（DMSO）均購(gòu)自重慶醫(yī)藥股份公司，5-FU、5-FUR前藥脂質(zhì)體（重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)系王馳副教授惠贈(zèng)）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人鼻咽癌HNE-1細(xì)胞在含10%的熱滅活新生牛血清的RPMI1640中種植，37℃，5%CO2飽和濕度、溫度培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，0.25%胰酶消化，傳代。使用臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)。

1.2.2 5-FU、5-FUR前藥脂質(zhì)體對(duì)HNE-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HNE-1細(xì)胞，消化、離心后加入培養(yǎng)液制成懸液，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，后分別加入終濃度分別為0.024μg/mL 、0.12μg/mL、0.6μg/mL、3.0μg/mL的5-FU和5-FUR前藥脂質(zhì)體，每一濃度重復(fù)4孔，將細(xì)胞培養(yǎng)板放置在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)72h后，每孔加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)，4h后加入DMSO，檢測(cè)每孔吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，并采用中效濃度公式[3]計(jì)算出5-FU和5-FUR前藥脂質(zhì)體對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的IC50。

表1 5-FU與5-FUR前藥脂質(zhì)體對(duì)HNE-1細(xì)胞增殖抑制作用的影響

1.2.3 流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)5-FU和5-FUR前藥脂質(zhì)體作用于實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的凋亡率：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞常規(guī)消化、離心后加入培養(yǎng)液制成懸液，計(jì)數(shù)后以每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，實(shí)驗(yàn)分別設(shè)3組：空白對(duì)照組、5-FU、5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質(zhì)體組。其中5-氟尿嘧啶組和5-FUR核苷前藥脂質(zhì)體組分別以0.045μg/mL的終濃度與實(shí)驗(yàn)細(xì)胞共同培養(yǎng)72h后，用不含EDTA的胰酶消化收集處理過(guò)的細(xì)胞5 ×105個(gè)，加入PI染液充分混勻避光反應(yīng)，4℃放置30min后用FCM檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：使用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。全部計(jì)量資料采用表示，2組資料比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 5-FUR和5-FUR前藥脂質(zhì)體對(duì)HNE-1細(xì)胞的體外抑制試驗(yàn)

通過(guò)細(xì)胞預(yù)實(shí)驗(yàn)我們得出空白脂質(zhì)體對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株的抑制率均＜10%，因此可忽略其對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的毒性作用。

在濃度為0.024μg/mL、0.12μg/mL、0.6μg/mL、3.0μg/mL的5-FU與5-FUR前藥脂質(zhì)體分別作用下，HNE-1細(xì)胞的增殖抑制率分別為：（22.01±1.17）%、（31.51±1.21）%、（60.87±3.11）%、（87.31± 2.19）%；（24.63±1.33）%、（63.15±1.73）%、（80.49±3.17）%、（91.16±4.28）%。在各濃度點(diǎn)，5-FUR前藥脂質(zhì)體作用于HNE-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率在各濃度點(diǎn)均高于5-FU，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。使用IC50公式計(jì)算出：5-FUR前藥脂質(zhì)體的IC50為0.087μg/mL；5-FU對(duì)HNE-1的IC50為0.261μg/mL；5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質(zhì)體的IC50是5-氟尿嘧啶的1/3，見表1。

2.2 流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率

對(duì)照組的凋亡率為：（1.37±0.91）%。采用終濃度為0.045μg/ mL的5-FU和5-FUR前藥脂質(zhì)體作用于HNE-1細(xì)胞的凋亡率分別為（6.31±0.17）%、（19.53±1.79）%，二者相比較，差異有顯著性（P＜0.05）。5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質(zhì)體組的凋亡率比5-氟尿嘧啶增加了13.22%，是5-FU的3倍。見圖1。

圖1 FCM檢測(cè)HNE-1細(xì)胞的凋亡率

3 討 論

脂質(zhì)體[4]作為一種具有良好靶向性，高選擇性和通透性的微囊泡是目前較為理想的抗腫瘤藥物載體。因其具有磷脂雙分子層液晶膜的結(jié)構(gòu)，可以包埋轉(zhuǎn)運(yùn)脂溶性和水溶性藥物，并使藥物從脂質(zhì)體中緩慢釋放，從而使藥物作用時(shí)間增加；還可通過(guò)細(xì)胞的融合和內(nèi)吞作用直接將藥物送入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，減少腫瘤藥物的使用濃度，降低對(duì)游離藥物對(duì)組織細(xì)胞的毒副作用，提高抗腫瘤藥物的療效，同時(shí)脂質(zhì)體進(jìn)入體內(nèi)能被降解，免疫原性小[5]。

5-氟尿嘧啶核苷是氟尿嘧啶類抗腫瘤藥物發(fā)揮作用的活性形式，也是制備多種抗腫瘤藥物的前體，其抗腫瘤活性遠(yuǎn)高于臨床上應(yīng)用的氟尿嘧啶類藥物，但引起毒副作用大，故未能應(yīng)用于臨床[6]。研究顯示將具有較強(qiáng)抗腫瘤活性的5-FUR結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，使其由水溶性轉(zhuǎn)變?yōu)橹苄裕儆弥|(zhì)體將其進(jìn)行包裹，制備成5-FUR前藥脂質(zhì)體，從而達(dá)到既能使其抗腫瘤活性得以發(fā)揮，又能降低其毒性的目的[7]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)5-FUR前藥脂質(zhì)體在體內(nèi)外抗腫瘤作用的研究較少。本實(shí)驗(yàn)以5-氟尿嘧啶為對(duì)照，本實(shí)驗(yàn)擬從細(xì)胞增殖抑制及細(xì)胞凋亡這兩方面研究5-FUR前藥脂質(zhì)體對(duì)人鼻咽癌HNE-1 細(xì)胞株腫瘤作用，對(duì)5-FUR前藥脂質(zhì)體抗腫瘤作用臨床應(yīng)用作一初探。

本實(shí)驗(yàn)以頭頸腫瘤中常見的鼻咽癌HNE-1細(xì)胞株為研究對(duì)象，以5-FU為對(duì)照，通過(guò)MTT法、FCM法檢測(cè)5-FUR前藥脂質(zhì)體對(duì)HNE-1細(xì)胞生長(zhǎng)增殖抑制和凋亡的影響。結(jié)果顯示：①5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質(zhì)體對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的IC50是5-FU的1/3倍，說(shuō)明5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質(zhì)體可明顯減少鼻咽癌HNE-1細(xì)胞內(nèi)抗腫瘤藥物的用量，降低藥物的毒性。這與Paola C[8]等研究發(fā)現(xiàn)5-FUR前藥脂質(zhì)體對(duì)HT-29細(xì)胞株具有較強(qiáng)的增殖抑制作用相符。②5-FUR前藥脂質(zhì)體和5-FUR作用于HNE-1細(xì)胞的凋亡率分別為（6.31±0.17）%、（19.53±1.79）%。5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質(zhì)體組比5-氟尿嘧啶的凋亡率減少了13.22%。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究顯示，與5-氟尿嘧啶相比較，5-氟尿嘧啶核苷前藥脂質(zhì)體對(duì)人鼻咽癌HNE-1細(xì)胞具有較強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用，能夠顯著誘導(dǎo)HNE-1細(xì)胞株凋亡。本實(shí)驗(yàn)為5-FUR前藥脂質(zhì)體作為氟尿嘧啶類藥物的新劑型在頭頸腫瘤方面的應(yīng)用作一初探。

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The Effect of 5-FUR Prodrug Liposome on Laryngeal Cancer HNE-1 Cell Line

LIN Li, DENG Bi*
（The People’s Hospital of Yubei District, Chongqing 401120,China ）

Objective To compare the Effect of the proliferation inhibition and apoptosis of HNE-1 cell line by 5-FU and 5-FUR prodrug liposome. Method MTT reduction assay was used to investigate the proliferation inhibition of 5-FU and 5-FUR prodrug liposome on HNE-1 cell line..FCM was used to detecet the apoptosis rate of cell after using the drugs. Result The IC50 of 5-FU on HNE-1 cell line was 300% to 5-FUR prodrug liposome. Treated with 5-FU and 5-FUR prodrug liposome respectively, the apoptosis rate of HNE-1 were:（6.31±0.17）%、（19.53±1.79）%. Conclusion 5-FUR prodrug liposome was better than 5-FU in inhibiting the proliferation and raising the apoptosis rate of HNE-1 cell line.

5-FUR prodrug liposome; HNE-1; Apoptosis

739.6

B

1671-8194（2013）33-0021-02

*通訊作者：E-mail：523141304@qq.com.