吡咯烷二硫氨基甲酸對大鼠急性腎損傷的保護作用及機制

唐 華，陳 蓉，張春梅，王順蓉，萬 英

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是目前臨床上患病率和病死率均較高的常見危重癥，其機制涉及炎癥免疫反應和氧化應激損傷等［1］。核因子-кB(nuclear factor-кB，NF-кB)作為調控多種炎癥介質基因表達的樞紐，在AKI的發生、發展中起重要作用［2］。吡咯烷二硫氨基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamat，PDTC)既是一種抗氧化劑，又是 NF-кB 的特異抑制劑，對心、肝、肺和腎臟多種疾病均具有保護作用［3-6］，但在AKI中的作用鮮有報道。本研究通過缺血性AKI大鼠模型，觀察PDTC對NF-кB下游炎癥因子及腎臟氧化應激反應的影響，探討PDTC對AKI的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康成年雄性SD大鼠，體質量250～300 g，清潔級，由瀘州醫學院動物實驗中心提供［合格證號:SCYK(川)2006-0004］。

1.1.2 主要試劑 NF-кB抑制劑PDTC購自Sigma公司，兔抗大鼠NF-кB p65多克隆抗體和辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)標記的羊抗兔二抗購自美國Santa-Scruz公司，增強型化學發光(enhanced chemi luminescence，ECL)檢測試劑盒購自美國Pierce公司，酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)雙抗體夾心法試劑盒購自武漢博士德生物有限公司，丙二醛及總抗氧化能力檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 模型建立與分組 大鼠用戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔麻醉，腹部正中切口，分離腎動靜脈，用無創動脈夾夾閉雙側腎動脈，60min后松夾計時，關閉腹腔切口。大鼠隨機分為假手術組(假手術組不夾閉腎動脈，從關腹開始計時)、AKI組和PDTC組，AKI組和PDTC組松夾后及假手術組按取材時間又分為3、6、12、24、48 h 組，每組 6 只。PDTC 組在松夾前0.5 h腹腔注射PDTC 100 mg/kg，假手術組和AKI組分別注射等量生理鹽水。

1.3 標本采集 于取材各時間點處死大鼠，取腔靜脈血3 ml，用于檢測血清肌酐(serum creatinine，SCr)和尿素氮(blood urea nitrogen，BUN);同時切除左腎，取部分腎組織常規制片，蘇木素和伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色觀察腎臟病理改變;其余腎組織經液氮迅速冷卻后置于-80℃冰箱保存待測。

1.4 腎細胞核內 NF-кB p65蛋白的表達 采用Western blotting法進行檢測。提取腎組織勻漿的核蛋白，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法定量。制備12%分離膠和6%濃縮膠，蛋白上樣量10μg。泳畢將蛋白電轉移至聚偏氯乙烯(polyvinylidendfluoride，PVDF)膜，用含5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的1×三羥甲基氨基甲烷-Tween緩沖液(tris buffered saline with tween-20，TBST)封閉過夜，加入NF-кB p65兔抗大鼠多克隆抗體(稀釋比例1∶800)，37℃孵育2 h;加入HRP標記的羊抗兔二抗(稀釋比例1∶2000)，37℃孵育 1.5 h;以 βactin為內參照ECL試劑盒進行化學發光，最后用凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)自動曝光、掃描，獲得各蛋白帶條光強度值(intensity，INT)。蛋白相對表 達 量 INT'= INT'各處理組/INT'假手術組，INT'=INT目的蛋白/INTβ-actin。

1.5 腎組織腫瘤壞死因子-α和細胞間黏附分子-1的表達 按照ELISA雙抗體夾心法試劑盒說明進行腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和細胞間黏附分子-1(intercellular adhesionmolecule-1，ICAM-1檢測。

1.6 腎組織丙二醛水平和總抗氧化能力檢測 采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)法測定腎組織勻漿中丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平，鐵還原法測定腎組織勻漿中總抗氧化能力(total-antioxidative capacity，T-AOC)，均按試劑盒進行操作。

1.7 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件，單因素方差分析，計量資料以均數±標準差(ˉx±s)表示，各組間兩兩比較用LSD法(方差齊時)或Dunnett's T3法(方差不齊時)，并檢驗NF-кB p65蛋白表達量分別與TNF-α、ICAM-1、MDA和T-AOC的相關性。

2 結果

2.1 腎功能和組織學檢查 AKI組各時間點血清SCr及BUN水平較假手術組顯著增高(P＜0.01);而PDTC組兩者水平較AKI組明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)，但仍然高于假手術組(P＜0.05)。AKI組和PDTC組隨著恢復灌流時間的延長，SCr及BUN水平均逐漸增高(表1)。

假手術組腎臟組織結構正常。AKI組腎臟病理變化明顯，鏡下見腎小管上皮細胞空泡變性、壞死、脫落，管腔內各種管型，腎間質炎性細胞浸潤。PDTC組腎臟病變比AKI組明顯減輕(圖1)。

表1 各組30例血清SCr和BUN水平±s)

表1 各組30例血清SCr和BUN水平±s)

注:與假手術組比較，△P＜0.01;與 AKI組比較，#P＜0.05，★P＜0.01

SCr(μmol/L)BUN(mmol/L)組別3h 6h 12h 24h 48h3h 6h 12h24h 48h假手術組 52.03±3.65 52.93±5.65 56.79±3.92 54.19±4.00 56.94±3.09 7.47±0.24 7.50±0.63 7.68±0.71 7.54±0.62 7.85±1.13 AKI組 145.51±15.94△ 163.06±17.49△ 219.09±11.11△ 254.79±19.09△ 298.76±13.80△ 12.59±1.04△ 17.93±3.02△ 24.51±2.99△ 30.18±1.92△ 45.77±3.19△PDTC組 70.16±3.04△★ 81.70±3.58△★ 104.04±9.38△★ 138.14±12.40△★ 166.75±13.00△★ 7.98±0.35★ 10.95±0.51△# 13.89±0.85△★ 19.88±1.21△★ 28.52±0.76△★

圖1 各組組織病理學改變(HE×600)

2.2 腎組織細胞核內NF-кBp65蛋白表達 AKI組各時間點腎細胞核內NF-кBp65蛋白的表達均較假手術組明顯增高(P＜0.01)，而同期PDTC組的表達較AKI組顯著降低(P＜0.01)。AKI組和PDTC組NF-кBp65蛋白表達均在恢復灌流3h達到高峰，之后略有下降，于恢復灌流24h表達再次上調(圖 2，表 2)。

圖2 各組腎組織細胞核內NF-κBp65蛋白表達(ˉ±s，n=6)

表2 各組30例腎組織細胞核內NF-κBp65蛋白相對表達量)

表2 各組30例腎組織細胞核內NF-κBp65蛋白相對表達量)

注:與假手術組比較，△P＜0.01;與 AKI組比較，★P＜0.01

組別 3h 6h 12h 24h 48h假手術組 1.01±0.15 1.03±0.23 0.97±0.06 0.99±0.09 1.00±0.10 AKI組 4.06±0.51△ 2.91±0.44△ 1.49±0.34△ 1.93±0.21△ 2.47±0.34△PDTC組 2.02±0.24△★ 1.26±0.23★ 1.11±0.18★ 1.33±0.10△★ 1.36±0.25△★

2.3 腎組織TNF-α和ICAM-1表達變化 AKI組各時間點TNF-α和ICAM-1的表達均較假手術組明顯增高(P＜0.01)，而PDTC組兩種細胞因子的表達均顯著低于AKI組(P＜0.01)。AKI組和PDTC組兩種因子均在恢復灌流3h表達達到高峰，TNF-α表達在恢復灌流6h稍有下調，之后表達再次增高;ICAM-1表達在恢復灌流3h達到高峰后，于6h和12h表達下降，表達再次上調出現在24h(表3)。

2.4 腎組織MDA和T-AOC變化 與假手術組相比，AKI組和PDTC組MDA水平升高(P＜0.01)，TAOC降低;而與AKI組同一時間點比較，PDTC各組MDA水平降低(P＜0.01)，T-AOC增高。AKI組和PDTC組MDA水平均于恢復灌流3～12h稍有下降，于24～48h再次增高;而T-AOC變化趨勢與此相反，于恢復灌流3～12h活性略有升高，于24～48h活性再次降低(表4)。

表3 各組30例腎組織TNF-α和ICAM-1表達變化(±s)

表3 各組30例腎組織TNF-α和ICAM-1表達變化(±s)

注:與假手術組比較，#P＜0.05，△P＜0.01;與 AKI組比較，★P＜0.01

組 別TNF-α (μg/kg)3h 6h 12h 24h 48h ICAM-1(μg/kg)3h 6h 12h 24h 48h假手術組 1.59±0.05 1.23±0.32 1.04±0.04 1.68±0.27 1.00±0.31 0.91±0.03 0.84±0.06 0.66±0.12 0.89±0.08 0.77±0.05 AKI組 6.89±0.43△ 6.01±0.11△ 6.35±0.24△ 6.67±0.31△ 7.34±0.64△ 1.92±0.13△ 1.52±0.08△ 1.27±0.09△ 1.73±0.12△ 2.23±0.10△PDTC組 4.04±0.38△★ 2.99±0.10△★ 3.24±0.05△★ 3.97±0.17△★ 4.58±0.08△★ 1.24±0.05△★ 0.99±0.17#★ 0.87±0.06△★ 1.06±0.12△★ 1.37±0.04△★

表4 各組30例腎組織MDA和T-AOC檢測±s)

表4 各組30例腎組織MDA和T-AOC檢測±s)

注:與假手術組比較，△P＜0.01;與 AKI組比較，★P＜0.01

組 別MDA(μmol/g)3h 6h 12h 24h 48h T-AOC(U/mg)3h 6h 12h 24h 48h假手術組 0.88±0.04 0.83±0.03 0.85±0.07 0.81±0.21 0.92±0.13 2.01±0.08 1.99±0.04 2.01±0.13 2.00±0.11 2.07±0.11 AKI組 3.47±0.42△ 3.31±0.06△ 3.00±0.19△ 3.58±0.22△ 3.72±0.19△ 0.55±0.14△ 0.66±0.06△ 0.73±0.17△ 0.59±0.13△ 0.47±0.20△PDTC組 2.04±0.35△★ 1.83±0.21△★ 1.46±0.05△★ 2.00±0.21△★ 2.47±0.16△★ 0.87±0.09△★ 1.24±0.07△★ 1.53±0.12△★ 1.15±0.17△★ 1.00±0.07△★

2.5 腎組織細胞核內NF-кB P65蛋白表達變化與其他指標相關性分析 腎細胞核內NF-кB p65蛋白表達分別與TNF-α和ICAM-1的表達呈正相關(r分別為0.487、0.614，P＜0.01)，與MDA 水平也呈正相關(r=0.436，P＜0.01)，而與 T-AOC活性呈負相關(r=-0.283，P＜0.01)。

3 討論

在腎臟手術、腎移植、急性缺血等原因所致腎臟低灌注過程中，腎小球濾過率急劇下降，可引起缺血性AKI。目前臨床上 AKI患者病死率高達30%～50%［7］，對AKI患者進行積極有效的防治是臨床醫生面臨的重要問題。

研究表明，由NF-кB調控的涉及 TNF-α、ICAM-1等多種炎癥介質的炎癥級聯反應在AKI過程中發揮重要作用［8］。NF-кB的活性可以進入細胞核內的p65亞單位來間接反映。PDTC既是一種抗氧化劑，又是NF-кB的特異抑制劑，可在NF-кB活化通道的不同水平發揮抑制作用，如抑制NF-кB p65亞單位，抑制卡巴B 蛋白(inhibition of kaba B protein，IкB)的降解，減少 NF-кB 核轉位等［9］。本研究顯示，AKI時NF-кB的活性與TNF-α和ICAM-1的表達變化呈正相關，均在恢復灌流3～48 h顯著增高;而PDTC組抑制NF-кB活化后，TNF-α和 ICAM-1表達明顯減少，同時血清SCr和BUN明顯降低，腎臟組織病理學損傷也減輕。表明PDTC可能通過抑制NF-кB，降低腎組織中TNF-α和ICAM-1表達量，減輕AKI所致的炎癥級聯反應，改善早期腎功能。

據報道，氧化應激可與炎癥反應相互影響，參與AKI過程，其共同的樞紐也在于NF-кB。AKI時，局部產生的氧自由基可激活NF-кB轉位入核，誘導相關炎癥基因的表達，而炎性損傷的細胞可進一步產生大量活性氧分子，加重脂質過氧化反應和氧化應激損傷［10］。MDA是脂質過氧化代謝產物，而 TAOC代表組織的總抗氧化能力，兩者可較好地反映組織氧化應激損傷程度。本研究顯示，AKI組較假手術組 MDA增多，T-AOC降低;而 PDTC組隨著NF-кB活性的降低，MDA減少，T-AOC增高，且NFкB活性分別與MDA和T-AOC的變化呈正、負相關。表明PDTC能通過抑制NF-кB活性，減輕AKI的氧化應激損傷。

綜上所述，PDTC對缺血性AKI具有保護作用，其效應可能與抑制NF-кB活化，從而減少下游炎癥因子TNF-α和ICAM-1的產生，以及減輕氧化應激損傷有關。這為缺血性AKI的臨床防治開辟了又一新途徑。

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