時間分辨熒光技術在乙型肝炎兩對半檢測中的應用研究

杜錦池

（云南省大理州人民醫院檢驗科，云南 大理 671000）

時間分辨熒光技術在乙型肝炎兩對半檢測中的應用研究

杜錦池

（云南省大理州人民醫院檢驗科，云南 大理 671000）

目的 對時間分辨熒光免疫分析技術（TRFIA）和酶聯免疫吸附試驗（ELISA）對乙型肝炎兩對半的測定結果的進行比較，從而對 TRFIA 在乙型肝炎兩對半測定中的臨床應用價值進行研究。方法 以 190 例醫院患者血清樣本作為標本，對 190 例血清樣本同時采用TRFIA 法和 ELISA 進行乙型肝炎兩對半的測定，對計算結果符合率進行分析比較。結果 使用 TRFIA 法和 ELISA 法測定 190 份隨機樣本HBV-M 結果符合率較高，對結果進行配對資料的 χ2檢驗，P＞ 0.05，無顯著性差異。結論 相比于 ELISA 法，TRFIA 在對乙型肝炎兩對半的測定方面具有更強的特異性和更高的靈敏度，是一種比較理想可靠的臨床乙型肝炎兩對半定量檢測方法。通過使用 TRFIA 對乙型肝炎兩對半進行定量測定，可以為乙型肝炎診斷、治療及預后提供全面及時的動態監測，為疫苗接種提供可靠依據。

TRFIA；ELISA；乙型肝炎兩對半；應用研究

乙型肝炎兩對半是國內醫院最常用的乙型肝炎病毒感染檢測血清標志物，病毒免疫學標記一共有3對，分別為HBsAg（表面抗原）和抗-HBs或HBsAb（表面抗體）；e抗原（HBeAg）和e抗體（抗HBe或HBeAb）；核心抗原（HBcAg）和核心抗體（抗HBc或HBcAb）。我國的乙型肝炎感染率在全球范圍內是比較高的，全球約有10%及以上的人口攜帶HBsAg，乙型肝炎病毒的總感染率已經達到33.8%～64.2%[1]。

目前國內臨床實驗室最常用的乙型肝炎病毒感染者的血清學標志物監測主要依靠酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法，而這種方法由于受到自身局限性的限制，只能進行定性分析不能判斷乙型肝炎兩對半具體含量，結果一般用“陽性”或“陰性”表示。這樣的情況明顯不能滿足療效觀察和疫苗注射的需要。因此我們需要一種具有更高靈敏度，更加快捷的方法來彌補ELISA法的不足。而TRFIA法是在80年代初發展起來的一項超微量免疫分析技術，它利用了穩定的稀土元素標記和增強液的放大效應，能夠最大限度地提高了檢測靈敏度，并且在特異性、測定穩定性以及測量自動化方面表現也較為優越，是替代ELISA的主要分析方法之一。在本文中，筆者同時對190例血清樣本分別使用TRFIA法和ELISA法對血清標本中的HBV含量進行檢測，并對兩種方法的測定結果進行分析比較，具體測定過程和結果如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源

檢測的乙型肝炎兩對半血清標本均來自本院于2012年1月至8月隨機門診患者和住院患者，一共190例。收集的血清中乙型肝炎患者有118例，其中男性86例，女性32例，患者平均年齡為37.9歲，所有病例的診斷均嚴格按照國家修訂的毒性肝炎防治方案標準進行。另外的72例來自保健科健康體檢人群，并且已排除乙型肝炎病毒感染可能性。所有樣本人員均于早晨空腹期間采靜脈血，及時分離血清后將樣本進行-20℃保存待測。

1.2 儀器和試劑

試劑：定性檢測采用北京科衛臨床診斷試劑有限公司提供的酶聯免疫吸附試驗試劑盒。定量檢測采用上海新波生物技術有限公司提供的配套試劑盒。質控物有廣州豐華生物工程有限公司提供。

儀器：酶標儀由奧地利Sunrise公司提供的128C酶標儀，時間分辨熒光免疫分析儀由上海新波生物技術有限公司提供，型號為EFFICUTA。

1.3 方法

同時采用TRIFA和ELISA對190例血清標本進行乙型肝炎兩對半測定，嚴格按照儀器及試劑操作說明進行操作和判斷結果。在使用ELISA法與TRFIA法測定HBV時，需嚴格按說明書進行并同時加入相應的質控物監測。

ELISA法的主要步驟：加樣，孵育，洗板，加酶或底物，顯色，比色，進行抗乙型肝炎病毒核心抗體測定稀釋時，應按照1∶30的比例進行。

TRFIA法的主要步驟：加樣，振蕩，洗板。加入事先配好的標記物工作液，再振蕩，洗板，加入增強液并振蕩，上機檢測，測定過程時間應控制在30min內。進行抗乙型肝炎病毒核心行體測定稀釋時，所按比例為1∶30[2]。

1.4 統計學分析

采用配對χ2檢驗對實驗結果進行統計學分析。

2 結 果

190份隨機樣本 TRFIA和ELISA法測定結果符合率如表1。

對表1進行觀察，我們發現TRFIA和ELISA兩種方法的測定結果符合率均在90%以上，且各項檢測項目的陰陽性結果在經過配對資料χ2檢驗后，均無顯著性差異，P＞0.05。

3 討 論

3.1 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

表1 TRFIA法和ELISA法對HBV-M測定結果

酶聯免疫吸附試驗（ELISA）的原理為，將以酶標記的抗體或抗原作為主要試劑，這種方法在標記免疫技術中是最為常用的，此方法具有操作簡單、方便快速以及實際有效期限較長等優點，適用于大批量的樣本檢測。但是其在特異性及靈敏度方面具有一定的缺陷，容易造成漏檢或假陽性等誤診情況的發生。且由于酶的純度反應過程受周圍環境因素影響較大，因此就造成了ELISA法穩定性較差的結果[3]。除此之外，由于ELISA檢測法只能對乙型肝炎兩對半各項指標的濃度做出籠統的檢測，而且檢測結果只能使用陰性或陽性表示，因此給實際臨床診斷和治療帶來諸多的不便，不是一種可靠全面的檢測方法。

3.2 時間分辨熒光免疫分析技術（TRFIA）

時間分辨熒光免疫分析技術（TRFIA）具有高靈敏度、零本底、試劑有效期長、穩定性好、線性范圍寬以及應用范圍廣等優點，這些優點的集合使得它當仁不讓地成為最具廣闊發展潛力的新興生物學技術，它的產生為標記免疫技術領域帶來了一次革新式的飛速發展。近年來該方法的不斷進步和發展，使得其迅速取代原有方法一躍成為當今各級醫療部門進行乙型肝炎兩對半檢測的一種最有效的主要方法。在對大批量樣本進行檢測時，TRFIA同樣能夠勝任并且檢測結果更加準確可靠。

3.3 TRFIA的優越性

TRFIA法是使用的三價稀土離子及其螯合劑作為示蹤物的，并且它使用的時間分辨熒光儀能夠將時間延遲，進而使得特異性熒光與非特異性熒光能夠很好地實現分離，這樣一來便可獲得準確的HBV-M的具體含量，在定量檢測方面具有獨特的優越性：①提高了乙型肝炎 HBsAg檢測靈敏度，可達0.2μg/L。傳統的ELISA法在乙型肝炎早期檢測HBsAg時是呈陰性的，而TRFIA能在急性乙型肝炎早期就準確地檢查出 HBsAg，對是否感染HBV進行確診，這一特點毫無疑問能大大縮短按“窗口期”時間[4]。另外，病毒一旦發生變異，其表達量是很低的，使用常規的ELISA法無法測出抗原，而TRFIA法因其優越的靈敏度能夠同時定量檢測出HBsAg和HBsAb。而且使用TRFIA法能夠為HBsAg濃度較低的攜帶者進行定量檢測，進而對其進行密切監測并及時采取措施以避免其發展成為乙型肝炎或慢性病攜帶者。②為病情及藥物治療效果提供動態觀察途徑，為醫師選藥及選擇治療方案提供科學依據。當醫生進行選藥時，可以使用TRFIA對患者用藥前后的血清學標志物濃度進行檢測，以獲得準確的定量分析結果，醫生便可以更具實際的療效大小為患者提供最準確適合的用藥方法。另外，TRFIA還能對HBsAg和HBsAb的濃度變化提供定量分析，為判斷急性乙型肝炎是否處于恢復期提供判斷依據。使用TRFIA定量檢測能夠將核心抗體濃度反應出來，進而可以為醫生提供判斷病毒感染狀態的指導依據，這一用法可以有效地進行抗病毒治療患者的篩選、療效觀察和停藥判斷。③在乙型肝炎預防中，TRFIA也有廣大的發揮空間，為注射乙型肝炎疫苗提供主導依據。當HBsAb含量＞100mIU/mL以上時人體才具有抵抗HBV入侵的能力[4]，因此通過TRFIA進行定量檢測后，醫師可以根據人體具體情況進行乙型肝炎疫苗注射工作。

通過對TRFIA和ELISA二者方法的實際研究比較，筆者認為，TRFIA法因其獨特的靈敏度和穩定度等優勢，必將受到廣大醫患雙方的歡迎和認可，進而成為正常人群對自身乙型肝炎病毒進行實時監測和預防接種的首選，也會成為乙型肝炎臨床治療動態觀察的主要方法。

[1]段正軍,徐杰.兩種方法對比檢測乙型肝炎病毒血清標志物[J].檢驗醫學與臨床,2007,4(7):636.

[2]張紅珊.時間分辨熒光技術在乙肝病毒標志物定量檢測中的應用[J].醫技與臨床,2009(5):98.

[3]周智,劉祀.乙型肝炎病毒標志物低水平復制的檢測及方法學比較[J].中華肝臟病雜志,2007,2(2):13.

[4]任建新.時間分辨熒光免疫法定量檢測乙肝兩對半的效果評價[J].中外醫療,2010,29(13):98.

R512.6+2；R446.1

：B

：1671-8194（2013）07-0202-03