黃連解毒湯對高脂血癥形成過程中小鼠腸道微生態(tài)的影響

鄺棗園馬 嫚宋夢微李 巖張 韌李 明

（1 廣州中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院 微生物與寄生蟲學教研室，廣東 廣州 510006；2 廣州中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院研究生部，廣東 廣州 510006；3 廣東藥學院基礎(chǔ)學院病理生理學教研室，廣東 廣州 510006）

黃連解毒湯對高脂血癥形成過程中小鼠腸道微生態(tài)的影響

鄺棗園1馬 嫚2宋夢微2李 巖1張 韌1李 明3

（1 廣州中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院 微生物與寄生蟲學教研室，廣東 廣州 510006；2 廣州中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院研究生部，廣東 廣州 510006；3 廣東藥學院基礎(chǔ)學院病理生理學教研室，廣東 廣州 510006）

目的 分析黃連解毒湯對高脂血癥小鼠腸道微生態(tài)的影響。方法 60 只雄性 C57BL/6 小鼠，隨機平均分為 6 組，即常規(guī)飼料組、高脂飼料組、常規(guī)飼料加抗生素組、高脂飼料加抗生素組、低劑量黃連解毒湯組 (195mg/mL)、高劑量黃連解毒湯組 (390mg/mL)。每組小鼠相應灌胃 28d 后，對各小鼠腸道糞便的細菌群落進行 PCR-變性梯度凝膠電泳 (PCR-DGGE)分析。結(jié)果 高脂飼料組的多樣性指數(shù)、物種豐度都高于其他各組；中藥高、低劑量組次之；高脂飼料加抗生素組兩指標均為最低。兩個抗生素組和中藥高劑量組都建立了新的較固定的細菌群落結(jié)構(gòu)。結(jié)論 高脂飲食能促進某些細菌的生長，這些細菌可能與高脂血癥發(fā)生相關(guān)，黃連解毒湯可能能抑制這些細菌的生長，調(diào)節(jié)腸道形成新的、穩(wěn)定的細菌群落結(jié)構(gòu)。

黃連解毒湯；高脂血癥；PCR-DGGE；腸道微生態(tài)

近年來的研究表明，黃連解毒湯及其配伍成分在心血管疾病的防治中起著越來越重要的作用，在臨床上已用于高血壓[1]、心絞痛[2]的治療。而也有研究表明腸道菌群與脂肪代謝具有密切的關(guān)系。本實驗主要通過PCR-變性梯度凝膠電泳技術(shù)（PCR-DGGE）研究高脂飲食同時施加黃連解毒湯之后小鼠腸道菌群的變化，以此來研究黃連解毒湯對高脂血癥形成過程中小鼠腸道微生態(tài)的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與儀器

C57BL/6小鼠購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（粵）2008-0002。黃連解毒湯由黃連、黃芩、黃柏、梔子組成，劑量按3∶2∶2∶3比例。黃連，批號：YPA2P0001；黃芩，批號：YPA2D0001；梔子，批號：YPA2D0001；黃柏，批號：YPA1J0001；均購于廣州采芝林藥業(yè)有限公司。氨芐青霉素，批號：L111136；鹽酸萬古霉素，批號：WM21392；滅滴靈，批號：G11122304；購自廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科。硫酸新霉素（Sigma，N6386），購自廣州市科因生物科技有限公司。糞便DNA提取試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司，批號：3030401jq。飼料：由廣東省醫(yī)學實驗動物中心配制，常規(guī)飼料配方見表1，高脂飼料配方：常規(guī)飼料83%；豬油10%；蛋黃粉5%；膽固醇1.5%；膽鹽0.5%。

表1 常規(guī)飼料配方

普通PCR儀，Veriti型（ABI，美國）；DGGE儀（Bio-rad，美國）；凝膠分析軟件Quantity One 4.6（Bio-rad，美國）。

1.2 實驗動物模型建立

60只C57BL/6雄性小鼠，17～20g。隨機分為常規(guī)飼料組，高脂飼料組，常規(guī)飼料加抗生素組，高脂飼料加抗生素組，中藥低劑量組及中藥高劑量組。抗生素組為：1g/L氨芐青霉素+500mg/L鹽酸萬古霉素+1g/L滅滴靈+1g/L硫酸新霉素，放在飲水中。中藥組為黃連、梔子、黃芩、黃柏水煎液，高劑量（18g∶18g∶12g∶12g）為390mg生藥/mL（每1mL水煎劑相當于416mg混合生藥），低劑量（9g∶9g∶6g∶6g）為195mg生藥/mL，根據(jù)《中藥藥理研究方法學》實驗動物與人按體表面積比等效劑量換算表換算所得。中藥高低劑量組每只動物每日灌胃0.4mL，連續(xù)灌胃28d。除常規(guī)飼料組及常規(guī)飼料加抗生素組外其余四組均給予高脂飼料。實驗過程中高脂飼料組、常規(guī)飼料加抗生素組、中藥高劑量組各死亡一只。四周后取血分離血清，將小鼠處死，解剖取腸道糞便。

1.3 血糖檢測

血糖儀為長沙三諾生物傳感技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品，血糖試紙為該公司安穩(wěn)型。

1.4 血清總膽固醇測定

所用總膽固醇試劑盒-CHO（酶法）為北京北化康泰臨床試劑有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品標準批號：YZB/京 0397-2012。

1.5 細菌16S rRNA基因的PCR及DGGE分析

用糞便DNA提取試劑盒提取小鼠腸道糞便細菌DNA。提取后的細菌DNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩＜毦?6S rRNA基因的PCR擴增按Muyer G等[7]的方法進行，擴增片段200bp。引物序列：F341-GC5'-CG CCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTAC GGGAGGCAGCAG-3'；R518： 5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'。PCR反應條件為：94℃4min；94℃30s，56℃30s，72℃60s，40個循環(huán)；72℃7min延伸。DGGE凝膠濃度8%，變性梯度范圍為40%～60% （100%變性包括40%去離子甲酰胺和7 M尿素），60℃恒溫80V電泳15h。之后用EB染色30min并用凝膠電泳成像系統(tǒng)掃描結(jié)果。

1.6 DGGE指紋圖譜分析

變性梯度凝膠電泳（DGGE）后的指紋圖譜用Quantity One 4.6分析。其參數(shù)設置[8]為：用軌道法（Lane）進行背景消除，“Rolling Disk Size” 取5-8之間；條帶識別時，“Sensitivity”取10，“Shadows”選“Reject”，用“Gauss-model Bands”對條帶進行處理；“Tolerance”選1%；之后用該軟件的“UPGAMA”法[9]進行聚類分析。

1.7 統(tǒng)計學方法

用SPSS 軟件進行統(tǒng)計學分析，采用Newman-kueuls法，P＜0.05表示差異為顯著，P＜0.01表示差異為極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組小鼠治療前后體重測定結(jié)果

見表2。各組小鼠在治療前體重差異無顯著性，治療后中藥高劑量組體重低于常規(guī)飼料組、高脂飼料組、常規(guī)飼料加抗生素組（P＜0.05）。

表2 各組小鼠治療前后體重測定結(jié)果比較(g，χ—±s)

2.2 各組小鼠血糖及血清總膽固醇測定結(jié)果

見表3。與常規(guī)飼料組比較，高脂飼料組血糖未見升高，常規(guī)飼料加抗生素組、中藥低劑量組血糖降低（P＜0.05），中藥高劑量組血糖顯著降低（P＜0.01）。與常規(guī)飼料組比較，高脂飼料組、高脂飼料加抗生素組、中藥低劑量組、中藥高劑量組血清總膽固醇顯著升高（P＜0.01）；與常規(guī)飼料加抗生素組比較，高脂飼料組、高脂飼料加抗生素組、中藥低劑量組、中藥高劑量組血清總膽固醇顯著升高（P＜0.01）；與高脂飼料加抗生素組比較，中藥低劑量組、中藥高劑量組血清總膽固醇升高（P＜0.05）。

表3 各組小鼠血糖及血清總膽固醇測定結(jié)果比較(χ—±s)

2.3 DGGE結(jié)果

不同實驗組小鼠糞便PCR-DGGE后的指紋圖譜（圖1）

圖1 各小鼠腸道菌群PCR-DGGE指紋圖譜

2.4 多樣性指數(shù)、物種豐度、相似性系數(shù)分析

圖2 各組小鼠細菌類群多樣性指數(shù)(H)和物種豐度(S)

表4 各組樣品的相似性指數(shù)(Cs)值

多樣性指數(shù)（H）、物種豐度（S）分析結(jié)果顯示（圖2），高脂飼料組的多樣性指數(shù)、物種豐度都高于其他各組；中藥高、低劑量組次之；高脂飼料加抗生素組兩指標均為最低。從各組相似性系數(shù)（Cs）可以得知（表4），高脂飼料組與常規(guī)飼料組相似性最高（0.63），高脂飼料加抗生素組、中藥低劑量組與常規(guī)飼料組相似性也比較高（0.59、0.48），而各組與兩個抗生素組相似性最低（0.16～0.19）。

2.6 聚類分析為了進一步分析各小鼠腸道群落結(jié)構(gòu)組問以及組內(nèi)的變化，由圖1A聚類分析結(jié)果可知常規(guī)飼料組聚為一簇；常規(guī)飼料加抗生素組聚為一簇。由圖1B聚類分析結(jié)果可知，高脂飼料組聚為一簇；高脂飼料加抗生素組聚為一簇。由圖1C聚類分析結(jié)果可知，中藥高低劑量組之間比較接近。由圖1D聚類分析結(jié)果可知，常規(guī)飼料組聚為一簇，高脂飼料組聚為一簇，兩個抗生素組各聚為一簇，中藥高劑量組聚為一簇，中藥低劑量組與常規(guī)飼料組和高脂飼料組都比較接近。

3 討 論

本研究用聚類分析發(fā)現(xiàn)，常規(guī)飼料組、中藥高劑量組、高脂飼料組、常規(guī)飼料加抗生素組、高脂飼料抗生素組小鼠腸道菌群大都各自聚為一類，說明這五組小鼠的腸道細菌組內(nèi)相似性較高，而組間差異性較大；也說明這五組小鼠腸道中有相對固定的細菌群落結(jié)構(gòu)，換而言之，兩個抗生素組和中藥高劑量組都建立了新的較固定的細菌群落結(jié)構(gòu)。而兩者不同的是，因抗生素組細菌種類數(shù)目（物種豐度）少，多樣性程度也較低，因此細菌群落結(jié)構(gòu)趨于不穩(wěn)定；而高脂飼料組與中藥高、低劑量組細菌種類數(shù)目較多，甚至多于常規(guī)飼料組，多樣性程度也較高，因此這三組細菌群落結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，而且比生理鹽水組更穩(wěn)定。而腸道細菌群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定與否直接體現(xiàn)了腸道微生態(tài)的穩(wěn)定與否。因此，這三組雖然改變了小鼠腸道微生態(tài)，但建立的新的腸道微生態(tài)系統(tǒng)應該更加穩(wěn)定。

中藥低劑量組的聚類情況不固定，即中藥低劑量組各只小鼠的腸道細菌差別很大，并且與其他各組的相似性、差異性，都不盡相同。說明低劑量黃連解毒湯可能不能形成固定的群落結(jié)構(gòu)。另外，高脂飼料組細菌種類數(shù)目最多，甚至遠多于常規(guī)飼料組，多樣性程度也是各組最高。有研究表明腸道菌群與脂肪代謝具有密切的關(guān)系[3]，因此我們猜測高脂飲食可能能夠改變腸道菌群結(jié)構(gòu)，而其中改變的細菌可能與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)，從而影響高脂血癥發(fā)病。黃連解毒湯可能能抑制這些細菌的生長，調(diào)節(jié)腸道形成新的、穩(wěn)定的細菌群落結(jié)構(gòu)。

[1]李 運倫.黃連解毒湯加減治療 高血 壓 病30例臨床研 究[J].國醫(yī)論壇,2000,15(2):38-39.

[2]夏 麗 婭 .黃 連 解 毒 膠 囊 治 療 不 穩(wěn) 定 型 心 絞 痛 32 例 [J].中 國 藥業(yè),2006,15(15):62-63.

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R285.5

：B

：1671-8194（2013）09-0085-03

廣東省科技計劃項目（編號2012B031800230）；廣東省普通高校重點實驗室中醫(yī)病機與治法研究實驗室開放課題；廣州中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院綜合基金研究生類研究項目