12C6+離子束輻照對大青葉生理生化特性的影響＊

李雪虎，陸錫宏，辛志君，周 翔，梁劍平

(中國科學院近代物理研究所，甘肅 蘭州 730000)

近年來發展起來的重離子束輻照與傳統的紫外線、X射線和γ射線相比具有更高的傳能線密度(Line energy transfer，簡稱 LET)、相對生物學效應(RBE)和更尖銳的電離峰(Bragg峰)等特點，能夠在低傷害前提下得到較高的誘變率和較寬的突變譜，突變體更穩定［1］，已廣泛應用于作物改良和誘變育種。近年來，中國科學院近代物理研究所用重離子誘變育種技術開展了多種植物材料的輻照研究，首次用重離子束輻照技術培育出“隴輻2號”小麥、大麗花、甜高粱和紫蘇等新品種［2-4］。

大青葉為十字花科植物菘藍的干燥葉，是一味常用中藥，具有清熱解毒、涼血利咽的功效，用于溫邪入營，高熱神昏，發斑發疹，黃疸，熱痢，痄腮，喉痹，丹毒，癰腫等［5］。臨床上則用作治療各種病毒性流行性感冒、乙型腦炎、單純皰疹病毒性角膜炎、流行性腮腺炎和病毒性肝炎等傳染性疾病［6］。隨著需求量的增大和對品質要求的提高，價值越來越受到人們的關注。但栽培品種及產地氣候不同，產量和有效成分含量存在較大差異，且質量不穩定。現有品種抗病性和抗蟲性較差，個別產地品種退化嚴重。采用12C6+離子束進行大青葉輻照育種的研究在國內外還未見報道。本文研究了不同劑量12C6+離子束輻照對苗期生理生化特性影響，為大青葉輻射育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

已經過三個世代的純化試驗大青葉種子，于4℃冰箱保存待用，植物種子標本保存于中國科學院近代物理研究所藥物研發中心。

1.2 輻照方法

輻照實驗在中國科學院近代物理研究所蘭州重離子研究裝置(HIRFL)生物輻照終端上進行。初始能量為100 MeV/u的12C6+離子束經過束流管道的鎳窗、電離室、空氣、降能片后照射樣品 (植物種子)，用空氣電離室監測注入量，樣品更換和數據獲取均由計算機控制，全部過程在室溫和大氣環境條件下進行，輻照劑量分別為20，40，50和 80 Gy，劑量率為10 Gy/min，沒有輻照的種子為對照。

1.3 幼苗培養

將不同劑量輻照處理的大青葉種子和對照組各100顆用紗布包好，用水浸泡過夜，75%酒精消毒2 min，用無菌水沖洗3次放入已滅菌的MS固體培養基(MurashigeandSkoog，1962)，每皿40粒，在室溫下晝夜交替培養。

1.4 生理生化指標及其測定

幼苗培養4周后，用鏟子從盆缽中完整地挖出大青葉幼苗，洗凈并收集根系和幼苗，進行生理生化指標測定，各組統計20株，所有指標測定每處理重復3次。具體指標及測定方法如下。

1.4.1 根系活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法進行［7，8］稱取根系鮮樣1 g，浸沒于盛有0.4%TTC和66 mmol/L磷酸緩沖液的等量混合液10 mL的燒杯中，于37℃保溫3 h，然后加入1 mol/L硫酸2 mL終止反應。取出根，小心擦干水分后與3 mL乙酸乙酯和少量石英砂一起在研缽中充分研磨，過濾后將紅色的提取液移入10 mL容量瓶，定容至10 mL，于 485 nm處測定 OD值，求出 TTC的還原量。

1.4.2 丙二醛(malondialdehyde，簡稱 MDA)含量的測定 MDA的檢測按照 Dhindsa等的方法［9］。MDA 含量(mmol/L)=6.45(OD532－OD600)－0.56×OD450［10］。

1.4.3 葉綠素含量采用李合生等的方法進行［11］稱取0.5 g新鮮幼苗葉片用丙酮浸提獲得色素提取液，然后以80%丙酮為對照，分別測定663 nm、645 nm處的光密度值。根據測量得到的光密度值代入公式計算葉綠素a和葉綠素b的含量。

1.4.4 酚酸類化合物含量 酚酸類化合物提取與測定參照文獻［12］的方法 以水楊酸為對照品。采用folin－ciocaiteu比色法;測定A763 nm處吸光度，根據線性方程求酚酸類類化合物含量。

1.4.5 酶活性測定 POD和 SOD提取:稱取1 g幼苗，加入5 mL提取緩沖液，在冰浴條件下研磨成勻漿于4℃，4000 r/min離心15 min，收集上清液低溫保存備用，測量提取液總體積［14］。還原型谷胱甘肽提取:稱取1 g幼苗，置于研缽中，加入5 mL經4℃預冷的50 g/L三氯乙酸溶液(含5 mmol/L Na2-EDTA)，在冰浴條件下研磨成勻漿，于4℃、10000 r/min離心20 min。收集上清液，測量提取液總體積［14］。酶液活性測定方法及藥品的配置均按照李玲等的方法［14］備用。

1.5 數據分析

對以上所獲得的數據用DPS數據處理系統進行統計分析［15］。

2 結果與分析

2.1 大青葉酚酸類化合物含量

不同劑量的碳離子束輻照處理后，其大青葉內酚酸類化合物含量的變化趨勢見圖1。0～80 Gy劑量范圍內大青葉葉片內酚酸類化合物含量隨輻照劑量增大而增加，對照組酚酸類含量為0.16 mg/mL，80 Gy時為0.24 mg/mL達最大;說明不同劑量的重離子束輻照都有利于大青葉片內酚酸類化合物的積累。

圖1 碳離子輻照對酚酸類化合物含量的影響Fig.1 Effect of12C6+ion irradiation on phenolic content

2.2 輻照對大青葉幼苗根系活力與生長的影響

大青葉根系是吸收養分和水分的主要器官，并進行一系列有機化合物的合成反應，對地上部的形態形成及新陳代謝過程起著極其重要的作用。不同輻照處理對大青葉幼苗根系活力的影響見圖2。由圖2可見，隨著劑量的增加大青葉根系TTC的還原強度均呈現下降的趨勢。特別是80 Gy處理極顯著地降低大青葉的根系活力。由此表明，80 Gy高劑量輻照處理對大青葉幼苗根系活力產生較大的抑制作用。

圖2 碳離子輻照對根系活力的影響Fig.2 Effect of irradiation on root vigor of seedlings

2.3 大青葉可溶性糖含量

圖3是12C6+離子輻照對可溶性糖含量的影響，在0～40 Gy，含糖量隨輻照劑量增大大幅增加，對照組的可溶性糖含量為0.867%，40 Gy時為2.98%，為最大值;40～80 Gy間隨輻照劑量增大而下降。這表明大青葉的含糖量隨碳離子輻照劑量增大，但輻照劑量高于40 Gy不利于可溶性糖的積累。

圖3 碳離子輻照對可溶性糖含量的影響Fig.3 Effect of12C6+ion irradiation on soluble sugar content

2.4 葉綠素含量

光合作用是植物合成碳水化合物的一個重要生理過程，而葉綠素是植物光合作用的基礎。不同劑量的12C6+離子束輻照處理后，其大青葉片內葉綠素a和葉綠素b含量的變化情況見圖4。兩種色素的變化趨勢基本一致，在0～50 Gy變化不大，略有降低，對照組葉綠素a和葉綠素b的含量分別為1.92和1.02 mg/g，50 Gy 時三者的含量分別為 1.71 和0.81 mg/g;到80 Gy色素含量降到最低分別為1.31和 0.60 mg/g。

圖4 碳離子輻照對葉綠素含量的影響Fig.4 Effect of12C6+ion irradiation on chlorophyll content

2.5 大青葉丙二醛(MDA)含量

丙二醛(MDA)是植物受環境脅迫后引起細胞膜脂過氧化而產生的副產物，其在細胞內積累量與細胞膜氧化損傷的程度密切相關。MDA的含量變化反映了質膜受損傷的程度。如圖5所示，隨著照劑量的增大，大青葉的MDA含量先升高，在40 Gy輻照處理組達到最大值，與對照組相比升78%(P＜0.01);50和80 Gy輻照處理組的MDA含量有所降低，分別比對照組升高了 51.6%和 43.9%(P ＜0.01)。

圖5 碳離子輻照對MDA含量的影響Fig.5 Effect of12C6+ion irradiation on MDA content

2.6 大青葉細胞抗氧化酶活性

不同劑量12C6+離子束輻照組的大青葉SOD活性均明顯高于對照組(P＜0.05)(圖6)。隨著0，20，40，50和80 Gy輻照劑量的增高，輻照組SOD活性先增高后降低，在40 Gy時達到最大值，為對照組的138%(P＜0.01)。50和80 Gy輻照組的POD活性有所升高，但仍明顯高于對照組。如圖6所示。

圖6 碳離子輻照對SOD活性的影響Fig.6 Effect of12C6+ion irradiation on SOD content

12C6+離子束輻照處理大青葉的POD活性隨輻照劑量增大呈先增后降的類“拋物線”趨勢(圖7)，40 Gy 時 SOD 活性達最大值(93.6 μg/g)，這表明碳離子輻照有利于提高SOD活性的積累。

圖7 碳離子輻照對POD活性的影響Fig.7 Effect of12C6+ion irradiation on POD content

3 討論

輻射誘變育種首先要確定適宜的輻照劑量，才可獲得有效的誘變。一般而言，隨著輻照劑量的增加，突變頻率也會相應的提高，但過高的劑量會干擾生物體正常的代謝，增加畸變率［16，17］。同時，每種生物體都有自身的生物學特性，它們對輻照處理的敏感性也各不相同。因此，開展大青葉干種子的輻照敏感性試驗是非常必要的，它是開展大青葉輻射育種的基礎。

在逆境條件下，植物體內可溶性糖會積累，以降低滲透勢和冰點，適應外界環境條件的變化，可溶性糖含量的變化在一定程度上可反映植物的抗逆性［2］。本實驗中，大青葉可溶性糖含量都有明顯積累，在40 Gy時達最大值，而50和80 Gy時反而下降。這可能是因為重離子束作為一種新型的誘變源，有較大的能量和質量沉積效應。當帶有一定電荷態的重離子作用于種胚時，其物理、化學和生物學綜合作用有可能引發種胚的突變［18］，進而導致植物相關生理特性發生不同程度的改變。

植物體內有許多酚酸類化合物，它們有抗氧化和抗菌等多種生理功能［19］。多酚在植物生理、生態上，尤其是抗蟲生理中也發揮著重要作用［20］。本研究中，0～80 Gy劑量范圍內大青葉內酚酸類化合物含量隨輻照劑量增大而增加，這可能是由于在中、低劑量重離子對樣品產生的傷害小［21］，有刺激效應，引發種胚發生突變，提高了它的抗逆性、抗氧化和抗病蟲害能力。

現在普遍認為，植物體內自由基的積累首先攻擊膜系統，使得膜脂脂肪酸的不飽和鍵被氧化，造成MDA含量的增加，損傷膜結構，嚴重時導致植物死亡，產生MDA，其積累量反映了植物受逆境傷害的程度［22-23］。本研究中，輻照處理組的MDA含量明顯高于對照組，產生大量 MDA，處理劑量40 Gy時，MDA含量高于對照.輻照劑量為40～80 Gy，MDA含量呈下降趨勢。這說明低劑量C離子輻射對生物膜造成損傷，中能重離子束輻照對大青葉能產生一定傷害，輻照劑量增大則可激活相關保護酶系統，減輕了重離子束輻照對自身的傷害。

植物根系是活躍的吸收器官和合成器官，根的生長狀況和活力水平直接影響植株生長和營養狀況及產量水平。根系活力大小一定程度上反映了植株吸收養分能力的強弱［24］。武振華等［3］研究發現，12C6+離子束輻照紫蘇種子后植株矮化、成活率降低。司婧等［1］發現輻照組的種子正常萌發后，其幼根停止生長，幼苗和幼根逐漸腐爛導致死亡，推測番茄種子根生長點是重離子輻照的敏感區域。本研究中也發現隨著劑量的增加大青葉根系活力均呈現下降的趨勢，充分證明了輻照損傷主要抑制了根的生長。輻照大青葉片內色素類化合物葉綠素a、葉綠素b等隨輻照劑量增大而略有降低，在葉片顏色上呈現暗綠，推斷是根受到損傷從而造成植株營養不良所致。

SOD和POD是植物體內2種重要的膜保護酶，能對細胞的傷害作出響應，同時消除自由基產生的傷害而起保護作用，對維持植物細胞自由基處于較低水平有重要作用。因此可認為，相應酶系的活性可作為作物輻照敏感性的測定指標。本試驗結果表明SOD活性表現為先上升后降低，處理劑量為20～40 Gy，二者活性逐漸增大，在40 Gy處有最大值，后又隨輻照劑量增大，活性顯著下降。這與周利斌等［25］(80 MeV/u的12C6+離子和50 keV的電子輻照沙打旺干種子)和薛林貴等［2］(12C6+離子束輻照紫蘇)的研究結果中MDA含量變化趨勢相同，都表現為先上升后降低。

總之，碳離子束輻照大青葉種子有利于大青葉中的可溶性糖、丙二醛和酚酸類類化合物含量的積累，40 Gy左右的輻照劑量有利于酚酸類化合物及抗逆性物質的積累。對大青葉抗逆性的提高和新品種的選育有重要意義。在輻射育種的后續研究中，還可將現代分子生物學研究技術引入到誘變育種工作中，以提高對有利變異的篩選與利用效率。

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